宽柄芥胞质雄性不育系的选育与主要性状鉴定

冷容，范永红，李娟，杨仕伟，刘雪姣，赵守忠

（重庆市渝东南农业科学院，涪陵，408000）

宽柄芥胞质雄性不育系的选育与主要性状鉴定

冷容，范永红，李娟，杨仕伟，刘雪姣，赵守忠

（重庆市渝东南农业科学院，涪陵，408000）

以茎瘤芥不育系JL154-5A为不育源，宽柄芥优良自交系为转育父本，通过杂交和连续回交的方法选育出4个具有代表性、不育性状稳定、经济性状良好的宽柄芥胞质雄性不育系DJA、K6A、HK-1A、K46A，对不育系的主要特征和农艺性状表现进行了调查，并用SSR分子标记进行了系统观察鉴定，确证是一批可以利用的宽柄芥优良胞质雄性不育系。

宽柄芥；胞质雄性不育系；选育；性状；鉴定

宽柄芥（Brassica junceavar.latipa）属芥菜类蔬菜的一个变种[1]，俗称笋壳菜、青菜、宽板菜等，是闻名于世的四川酸（泡）菜的主要原料，也是市民鲜食或农户常作饲用的蔬菜种类之一。因其叶柄及中肋宽大肥厚、质地脆嫩，且有一定辛辣味，煮汤或涮火锅味道尤美，具去热、御风湿、利五脏、补天阳、促进血液循环之功效[2]，所以颇受世人喜爱。但目前，国内外还未见有关宽柄芥胞质雄性不育系的选育与研究的报道，限制了该作物杂种优势利用工作的开展。本项研究从2010年8月开始，利用重庆市渝东南农科院范永红等[3]培育出的茎瘤芥（榨菜）胞质雄性不育系JL154-5A为不育源，以宽柄芥中的优良品种为转育父本，通过杂交和连续回交等方式，培育出4个具代表性、不育性状稳定、经济性状良好且各具特色的宽柄芥胞质雄性不育系，为较大规模开展宽柄芥杂交一代新品种的选育、实现“三系”配套，进而为提高酸（泡）菜原料作物的产量及品质提供了条件和可能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

①不育源 重庆市渝东南农科院范永红等[3]培育出的茎瘤芥胞质雄性不育系JL154-5A。

②转育父本 2011年3月，在田间系统鉴定并确证JL154-5A不育性状的基础上，选择4个具代表性的不同性状、不同生态类型、不同熟性的宽柄芥优良自交系（DJ、K6、HK-1、K46）作转育父本。

③观察鉴定的不育系及其保持系 DJA、K6A、HK-1A、K46A和DJB、K6B、HK-1B、K46B。

④SSR分子标记鉴定材料 选取经回交7代且特征及性状表现稳定的各不育系及对应保持系的幼嫩叶片组织。

1.2 试验方法

①以茎瘤芥不育系JL154-5A作母本，宽柄芥优良自交系作父本进行常规杂交，后代择取典型单株与父本连续回交8代，选育不育性状稳定、经济性状良好的宽柄芥胞质雄性不育系。

②在杂交和各回交世代，花期进行单株套袋自交，考察其自花授粉的结实性。

③对回交7代（不育系）及其父本（保持系），随机抽选3～5株典型单株在盛花期分别观察测定花冠、雄蕊、雌蕊和蜜腺的形状及大小，并对其开花特性进行系统观察。

④对回交7代（不育系）及其父本（保持系）的花粉，用0.5%的氯化三苯四氮唑（TTC）液在38℃恒温下染色50 min，测定其生活力。

⑤对不育系和保特系，在重庆市渝东南农业科学院（海拔273 m）进行正季种植，常规管理，各材料现蕾时，每材料选取5株典型单株，按《芥菜类蔬菜田间试验观察记载项目及标准》，系统观察其形态特征和主要性状表现。

⑥不育系SSR分子标记鉴定，选用十字花科芸薹属网公布的600对SSR引物，均由生工生物工程有限公司代理合成，并采用CTAB法提取全基因组DNA，然后分别进行PCR反应、电泳及银染等。

2 结果与分析

2.1 宽柄芥胞质雄性不育系的选育

2010年10月将茎瘤芥不育系JL154-5A在重庆市渝东南农业科学院试验地进行播种育苗移栽，2011年3月在开花期对不育系花器官构造、不育性状表现进行了观察鉴定，确证为不育性彻底、性状稳定的不育系后，以茎瘤芥不育系JL154-5A作母本，选取4个优良宽柄芥自交系（每自交系3株单株），与之分别成对杂交，得到F1代。2011年8月夏繁，从F1代中选择3株典型单株作母本，用上述对应的自交系回交，同时母本单株自交测定其结实性。连续4 a（2011-2014年）的春季和夏季，继续用宽柄芥自交系作轮回父本与之回交，同时母本单株套袋自交，测定其育性。到2015年5月选育出了不育度达100、不育株率为100%，经济性状良好且稳定的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系4个。

2.2 宽柄芥胞质雄性不育系形态特征及主要农艺性状表现

2014年9月至2015年2月，对已经完成回交转育并经育性鉴定达不育系标准的4个不育系和保持系，集中在渝东南农业科学院同一生态条件下栽培，对其形态特征和主要农艺性状进行了系统观察鉴定（表1）。

经连续7代回交转育后的宽柄不育株系，在叶形、叶缘、中脉颜色、叶片刺毛蜡粉、单株有效叶片数等方面，均与对应的保持系表现相同或相近，但在株高、开展度、单株鲜质量、中肋宽及厚度等方面，与对应的保持系有不同程度的差异，即不育系比对应保持系的植株高2～4 cm，开展度大4～9 cm，单株鲜质量大100～300 g等，同时，不育系的营养生长期比对应保持系长3～5 d。

2.3 宽柄芥胞质雄性不育系花器官特征及性状表现

2014年3～5月，在继续进行宽柄芥不育系回交转育的同时，对不育系和相应保持系的花器官形态特征、开花特性及花期变化进行了系统观察（表2）。

①不育系的花器官特征 调查发现，保持系的花冠由4片花瓣组成，呈“十”字形，黄色或浅黄色，雄蕊6枚、4强2弱；雌蕊单生，柱头表面多乳突，花药和花丝的长度稍大于花柱的长度，花药较饱满；蜜腺发育良好，3～4个，圆形，绿色或浅绿色，个别深绿色。

经连续回交7代转育的宽柄芥不育系花器官与对应的保持系相比较，在形态特征和结构上的差别为：盛花时不育系花瓣表现为半开或全开，呈不规则的“十”字形；每朵花雄蕊5～6枚，但花药干瘪、纤瘦，有棱或多棱；花丝比保持系短0.87～1.45 mm；雌蕊单生，柱头表面多有乳突，子房外观形态和大小与保持系基本相同；蜜腺发育良好，与对应的保持系没有明显差异。

②不育系的开花特点 经连续7代回交转育的宽柄芥不育系，几乎每朵花的柱头在花蕾成熟之前就伸出蕾外2.1～3.1 mm，形成特殊的花柱异长期，此时人工授以正常的芥菜花粉能够正常结实结籽，平均结实率达90%以上。柱头外露2～3 d后，花瓣才全展开或半展开，呈不规则的“十”字形，再经2～3 d花瓣脱落，柱头表面变黑。而对应的保持系花蕾没有异长期，每个花蕾从萼片裂开到花瓣展开仅3～4 h就呈“十”字形，再经1～2 d花瓣脱落。在植株的开花顺序、每天的开花时间等方面，不育系与对应的保持系没有明显的差别。

表2 宽柄芥胞质雄性不育系花器官特征及开花特点

③不育系的花期 与对应的保持系相比，经连续7代回交转育的宽柄芥不育系的始花期一般推迟2～3 d，盛花期和终花期相应推迟3～5 d，整个花期持续20～27 d，长的达29 d以上，即不育系的花期比保持系长5～6 d。

2.4 宽柄芥胞质雄性不育系的育性

①雄蕊的育性 a.自然生态气候条件下的育性。2011-2015年，在对宽柄芥雄性不育株系的每个世代进行回交转育的同时，对中选单株进行了套袋自交测定，除发现个别材料的回交世代株系有单株自交结实指数≥1（已淘汰）的情况以外，未发现有自交结实现象。2014-2015年，又对经回交6代后的DJA、K6A、HK-1A、K46A 4个具代表性的不育系及对应保持系的单株自交结实情况进行了系统考察，4个不育株系春季及夏季的自交结实指数均为0，表现为高度的不育且育性稳定；而保持系在不同的季节结实率差异较大，一般是春季结实率高于夏季，这可能与夏季气温较高、植株营养体小有关。

b.不育系花粉的生活力。2014年3月，对DJA、K6A、HK-1A、K46A 4个具代表性的不育系及对应的保持系的花粉进行染色镜检观察。结果表明，不育系的花粉粒均不着色，且多数花粉呈不规则圆球形、透明，部分花粉粒还有开裂、缺失现象，花粉粒边沿呈乳突状（图1）；而保持系的花粉着色率为85%～96%，表现为有生活力的花粉占绝大多数，花粉粒的形状多为圆球形或椭圆形，不透明、饱满。

②雌蕊的育性 2011-2015年，每个世代的回交转育结果表明，宽柄芥不育系（或不育单株）的雌蕊柱头在人工授粉后，不但能结实结籽，而且后代生长发育正常，不存在生殖隔离。同时，观察不育系雌蕊的形态特征，均未发现与对应的保持系（或回交父本材料）有质的差异。由此证明，宽柄芥雄性不育系的雌蕊育性是完全正常的。

图1 不育系DJA和保持系DJB花粉生活力测定

2.5 宽柄芥胞质雄性不育系SSR分子标记多态性鉴定

2016年1～4月，对培育出的4个具代表性的宽柄芥雄性不育系及保持系 （DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和 K46B）进行了SSR分子标记筛选鉴定。图2结果表明，引物KBJ416（F：5'-TATCAACAGAAACGCACCGAG-3'；R：5'-CCACTTGTTTCTCTCTCTAG-3'）在不育系及保持系中扩增出的条带呈多态性，且在不育源和经连续回交转育的不同宽柄芥胞质雄性不育系上扩增的条带完全一致，而与对应的宽柄芥保持系扩增出的带型表现有显著差异。

3 结论与讨论

本研究以茎瘤芥胞质雄性不育系JL154A为不育源，通过杂交和连续回交转育而成的宽柄芥胞质雄性不育系，不但不育性彻底，不育性状稳定，而且育性不因环境条件的改变而变化，另外，其经济性状良好，与对应的宽柄芥保持系无质的差别，是一批可利用的宽柄芥胞质雄性不育系，为大规模开展宽柄芥杂种优势的利用奠定了基础和提供了可能。

图2 引物KBJ416在宽柄芥不育系及保持系中多态性分布

陈竹君等[4]对榨菜雄性不育雄蕊形态的分类和遗传表现的研究结果及范永红等[3]对茎瘤芥胞质雄性不育系的定义证明，芥菜（茎瘤芥）胞质雄性不育类型在不同环境条件下表现育性稳定，不因环境条件的变化而发生育性的改变。据此认为，DJA、K6A、K46A、HK-1A 4个具代表性的宽柄芥雄性不育应属胞质互作不育类型，其不育性状可能是由细胞核内的不育基因和不育细胞质共同作用的结果。因为本研究所选育的宽柄芥雄性不育系的不育源为茎瘤芥JL154-5A，并经过4个年度不同生长季（春季和夏季）的回交转育证明，每个回交世代单株套袋自交结实指数均为0，后代无可育株出现，该不育系的不育性状非常稳定，不育株率达100%，表现为高度不育。

本研究筛选的SSR引物KBJ416，可成功地将宽柄芥不育系及保持系区分开来，且不育源的条带和不育系的条带表现完全一致，表明引物KBJ416与宽柄芥胞质雄性不育系的不育源（茎瘤芥不育系JL154-5A）基因相连锁，可以用来辅助进行不育系株系纯度鉴定和为该类不育系的保存与保护提供分子标记手段，也为宽柄芥不育基因分子标记辅助育种技术体系的建立奠定了基础。

[1]刘佩瑛.中国芥菜[M].北京：中国农业出版社，1994：46-56.

[2]李时珍.本草纲目.白话精译[M].北京：科学技术出版社，2006.

[3]范永红，周光凡，陈材林.茎瘤芥胞质雄性不育系的选育及其主要性状调查[J].中国蔬菜，2001（5）：4-7.

[4]陈竹君，张明方，汪炳良，等.榨菜胞质雄性不育系及其农艺性状的研究[J].园艺学报，1995，22（1）：40-46.

Breeding ofBrassica junceaCMS and Identification of Main Characteristics

LENG Rong,FAN Yonghong,LI Juan,YANG Shiwei,LIU Xuejiao,ZHAO Shouzhong
(Southeast of Chongqing Academy of Agricultural Sciences,Peiling 408000)

Using the mustard male sterile lines JL154-5A as sterility source,and fine cultivars ofBrassica juncea(inbred lines)as male parents,fourB.junceaCMS,DJA,K6A,HK-1A and K46A,with representativeness,stable sterile characteristic and fine economic characteristic,were obtained through cross hybridizing and continuous back cross.This paper systematically observed and identified the main characteristics,agronomic trait expression and SSR molecular marker of the male sterile lines,and confirmed that a lot of goodB.junceaCMS could be utilized in future actual production.

Brassica juncea;Cytoplasm male sterile lines(CMS);Breeding;Characteristic;Identification

S637.2

A

1001-3547（2016）22-0049-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.22.018

重庆市涪陵区科技项目（FLKJ.2012ABB1078）；重庆市应用开发重点科技项目（cstc2014yykfB80005）

冷容（1975-），女，本科，高级农艺师，专业方向为芥菜遗传育

种与栽培，电话：15095820339，E-mail：fllengrong@163.com

2016-09-23