HPLC法检测不同剂量60Co辐照对蛇胆陈皮散的影响

李艳萍，曾煦欣，黄珠爱，谭 珍，吴剑峰*

（1.佛山科学技术学院 药学系，广东 佛山 528000；2.佛山冯了性药业有限公司，广东 佛山 528000；3.佛山市药学会，广东 佛山 528000）

HPLC法检测不同剂量60Co辐照对蛇胆陈皮散的影响

李艳萍1，曾煦欣1，黄珠爱1，谭 珍2，吴剑峰1*

（1.佛山科学技术学院 药学系，广东 佛山 528000；2.佛山冯了性药业有限公司，广东 佛山 528000；3.佛山市药学会，广东 佛山 528000）

目的通过比较60Co辐照前后蛇胆陈皮散中主要成分橙皮苷的含量变化，考察不同辐照剂量对蛇胆陈皮散质量的影响。方法采用高效液相色谱法，色谱柱Agilent ZorbaxSB-C18（4.6×150mm，5μm），流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液（35:65），流速为1mL/min，柱温为26℃，检测波长为283nm，进样量20μL，统计学分析方法为SPSS单因素分析。结果每g样品计算，辐照剂量0、2、6和10kGy橙皮苷的量分别为43.37、42.32、35.93和42.43mg。结论实验辐照剂量下，橙皮苷含量均符合药典标准。辐照剂量为2 kGy和10kGy的60Co辐照对蛇胆陈皮散中的橙皮苷的含量无影响，而辐照剂量为6kGy的60Co辐照可使蛇胆陈皮散中的橙皮苷的含量显著减少。

HPLC法；60Co辐照；蛇胆陈皮散；橙皮苷

中药制剂药材组成种类多，成分复杂，原料来源广泛，且在药材加工和贮存的过程中易受到细菌污染，所以在保证用药的有效性和安全性的前提下，若要获取最大的经济效益，则必须结合药物性质合理选择灭菌方法［1］。60Co辐照灭菌是一种冷灭菌法，主要机理为直接破坏细菌的遗传物质从而使细菌失去遗传和合成蛋白质的能力后致其死亡［2］。其特点为穿透力强、操作方便和残留量低［3］，因此适用于含挥发油、不耐热等中药或中成药的灭菌。本文主要利用HPLC检测手段，测定60Co不同辐照剂量下蛇胆陈皮散中橙皮苷的含量，并利用统计学方法分析辐照剂量组之间的差异性，从而得到60Co灭菌法是否影响蛇胆陈皮散质量的结论。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（1260型，美国Agilent）；电子天平（BS-110S，法国赛多利斯）；超声波提取（AS5150B）；实验室纯水系统（密理博，ZTLH00005）；移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）；蛇胆陈皮散由佛山冯了性药业有限公司提供，批号为B13007。橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110721-200613）；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。统计学分析用SPSS软件进行。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇超声溶解，用50％甲醇稀释得对照品溶液（50μ g/m L）。进样前用0.45μ m微孔滤膜过滤。

2.2 供试品溶液的制备

分别取不同剂量60Co辐照（0，2，6，10kGy）的供试品约2.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，称定质量，放置30min，至样品粉末完全浸润，超声处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减少的重量。滤过，精密量取续滤液l mL，置50mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，有机微孔滤膜（0.45μ m）过滤，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（4.6×150mm，5μ m），流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液（35:65），流速1mL/min，检测波长283nm，柱温26℃，进样量20μ L，检测时间30min。

2.4 系统适用性试验

利用2.3项的色谱条件，得到橙皮苷对照品溶液（a）与蛇胆陈皮散供试品溶液（b）的色谱图。结果见图1。橙皮苷的出峰时间约为16.3min，对称因子约为0.95，供试品中橙皮苷色谱峰与相邻成分色谱峰的分离度较好，对照品与供试品中的橙皮苷色谱峰的理论塔数均大于2 000，证明此色谱条件的系统适用性良好。

图1 橙皮苷色谱图（1：橙皮苷色谱峰）

2.5 线性关系考察

将橙皮苷对照品溶液（50μ g/mL），按照一定比例用50％的甲醇将其稀释到6个浓度，按照2.3项的色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。得到橙皮苷的回归方程为y= 45.27x-4.032 5，r=0.9997（n=6）。结果表明橙皮苷在8.4～50μ g/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取橙皮苷对照品溶液，按照2.4项的色谱条件连续进样5次，按照峰面积计算，得到RSD值为0.77％，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号（B13007）样品6份，按2.2项方法平行制备供试溶液进行测定，结果橙皮苷的平均含量RSD（n=6）为1.2％，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的蛇胆陈皮散供试品溶液9份，分别精密加入已知含量的橙皮苷对照品溶液适量。按照2.3项的色谱条件进行测定，计算平均加样回收率。结果如表1所示。供试品中橙皮苷的回收率在均在95％～105％的区间内，平均回收率为100.29％，RSD为1.95％。表明方法的准确度良好。

表1 橙皮苷加样回收率试验结果

2.9 含量测定

取2.2项制备的0，2，6，10kGy辐照剂量的供试品溶液进行色谱检测，平行操作3次，采用2.5项的回归方程计算样品中橙皮苷的含量。结果见表2。

2.10 统计学分析

运用SPSS软件的单因素方差分析（One way ANOVA）模块分析2，6和10kGy辐照剂量组橙皮苷的含量与0kGy组的差异性，所得的P值见表3。

表2 不同辐照组中橙皮苷的含量

表3 各辐照剂量组橙皮苷的含量测定与统计学分析结果

由表3可知，辐照剂量0、2、6和10kGy的蛇胆陈皮散中橙皮苷含量分别为43.37、42.32、35.93、42.43mg/g，均符合2010版中国药典的标准（不少于30.0mg/g）［4］。与0kGy组（43.37mg/g）比较，2 kGy与10kGy组的P值分别为0.102和0.144，均大于0.05，表明它们与空白组之间不存在统计学差异，即辐照剂量为2 kGy和10kGy对蛇胆陈皮散中橙皮苷的含量无明显的影响。6kGy辐照剂量组的P值为0.000，小于0.01，表明它与空白组之间存在显著性差异，即6kGy的辐照剂量可使橙皮苷的含量显著减少，在本次试验中测得的下降率为17.15％。

5 讨论

5.1 色谱条件的选择

在2010版中国药典中，检测蛇胆陈皮散的橙皮苷成分色谱条件是流速1mL/min，柱温26℃，流动相（甲醇:0.1％磷酸溶液）的比例为40:60［5］。参照这个条件，首次实验中供试品的橙皮苷色谱峰与相邻成分的色谱峰未能完全分离。在保持流速和柱温不变的前提下，降低甲醇比例至35％，发现供试品的橙皮苷色谱峰与相邻成分的色谱峰能完全分离，峰形和对称因子等都较好，出峰时间为16min左右。为了加快出峰，尝试升高柱温到30℃，发现橙皮苷色谱峰保留时间提前不到1min。权衡比较后，最终采用2.4项的色谱条件，即流速为1mL/min，柱温为26℃，流动相（甲醇:0.1％磷酸溶液）比例为35:65。

5.2 样品溶剂的选择

本次实验中溶剂的选择对峰形影响较大。如图2所示，当采用100％甲醇作为溶剂直接进针检测时，橙皮苷色谱峰会出现肩峰现象（图2a），推断原因可能是由于溶剂与流动相的极性差别较大。因此，采用50％甲醇溶作为溶剂，肩峰现象消失，色谱峰的对称因子在0.95左右，如图2所示。

图2 橙皮苷色谱图

5.360Co辐照对橙皮苷成分影响的分析

含量测定结果表明，与未辐照样品相比，2和10kGy的辐照剂量不影响橙皮苷成分的含量。但辐照剂量为6kGy时，橙皮苷的含量显著性减少。表明这一辐照强度将对蛇胆陈皮散的药品质量造成一定的影响。不过减少后的含量依然符合药典标准，因此尚不影响药品的使用和疗效。为了验证实验结果的正确性，进行了多次的提取测定工作，尽量排除可能的人为误差，但多次实验结果都保持着一致性，即6kGy的辐照剂量下橙皮苷的含量会显著降低。目前造成含量降低的原因尚在进一步的研究之中。

6 结论

在我国卫生部颁布的《60Co辐照中药灭菌剂量标准》中，陈皮被列为允许辐照灭菌的药材品种，但蛇胆陈皮散却未被纳入。目前亦尚无关于60Co辐照灭菌对蛇胆陈皮散质量影响的相关报道。本论文利用高效液相色谱法检测60Co辐照灭菌对蛇胆陈皮散质量的影响，选择主要成分橙皮苷作为检测对象进行含量测定。结果表明，辐照剂量为2和10kGy对橙皮苷的含量无明显影响，而辐照剂量为6kGy时橙皮苷含量显著减少（约17％）。总的来说，在本实验所有剂量的60Co辐照处理后，橙皮苷含量依然符合药典标准。本论文的研究结果可以为蛇胆陈皮散采用60Co辐照灭菌提供一定的理论依据。

［1］陈天朝,徐丽军,宋薇.中药固体制剂灭菌技术研究现状、问题及对策［J］.中医学报,2013,28（7）:1015-1517.

［2］王锦燕.60Co-γ辐照灭菌在中药及其制剂中的应用［J］.现代中药研究与实践,2013,17（6）:59-60.

［3］姚道鲁,李奉勤,史东霞,等.60Co-γ射线辐照灭菌在中药方面的应用研究新进展［J］.辽宁中医药大学学报,2008,10（10）: 181-182.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.2010年版.北京:中国医药科技出版社,2010:1078-1079.

［5］苏德模,王藏徐,徐玉华,等.60Co-γ射线辐照灭菌中成药的最佳辐照剂量选择（一）［J］.药物分析杂志,1990,10（5）: 280-283.

【责任编辑：周绍缨410154121@qq.com】

Evaluating on Shedan-Chenpi Powder after different irradiation doses of60Co by HPLC method

LI Yan-ping1,ZENG Xu-xin1,HUANG Zhu-ai1, TAN Zhen2,WUJian-feng1*

（1.Department of Pharmacy,Foshan University.Foshan 528000,China; 2.Foshan Feng Liao Xing Pharmaceutical Company,Foshan 528000,China; 3.Foshan Pharmaceutical Society,Foshan 528000,China）

Aim To compare the contents of hesperidin in Shedan-Chenpi powder after different irradiation doses of60Co-γ and find the influence of radiations.Methods The chromatographic column Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm,5μm)was adopted.The mobile phase consisted of methanol-0.1％phosphoric acid solution (35:65)at the flowrate of1ml/min.The column temperature was 26℃.UV detection wavelength was 283nm and the sample volume was 20μL.The results were further analyzed by SPSS one way ANOVA method.Results The contents of hesperidin in Shedan-Chenpi powder from the irradiation doses of 0kGy,2 kGy,6kGy and 10kGy were 43.37mg,42.32 mg,35.93mg and 42.43mg per 1gram respectively.Conclusion The contents of hesperidin from all irradiation doses met the requirement of Chinese Pharmacopoeia.The irradiation doses of 2 kGy and 10kGy had no effect on the contents of hesperidin,and the irradiation doses of 6kGy could significantly reduce the content of hesperidin in Shedan-Chenpi powder.

HPLC;60Co irradiation;Shedan-Chenpi powder;hesperidin

R286

A

1008-0171（2016）06-0065-05

2016-09-13

佛山社会组织发展专项扶持基金项目资助（20140430）

李艳萍（1985-），女，广东肇庆人，佛山科学技术学院助教，理学博士。*

吴剑峰（1960-），女，江苏无锡人，佛山科学技术学院教授，理学博士。