CD147在不明原因自然流产患者绒毛组织的表达*

唐传玲， 滕晓明， 车 映， 李大金

(1同济大学附属第一妇婴保健院，上海 201204； 2复旦大学附属妇产科医院，上海 200011)



CD147在不明原因自然流产患者绒毛组织的表达*

唐传玲1， 滕晓明1， 车 映1， 李大金2△

(1同济大学附属第一妇婴保健院，上海 201204；2复旦大学附属妇产科医院，上海 200011)

目的： 分析CD147在不明原因自然流产患者绒毛组织中的表达水平，并探讨其生物学功能。方法:收集人早孕期正常和不明原因自然流产妇女的绒毛组织，采用免疫组织化学、RT-PCR 和Western blotting法检测CD147的表达，比较CD147在正常早孕与不明原因自然流产妇女绒毛组织的表达差异。体外分离纯化获得正常人早孕期滋养细胞，采用免疫细胞化学验证CD147在滋养细胞的表达，引入抗CD147中和性抗体处理人滋养细胞，采用BrdU增殖实验和Transwell侵袭实验分析滋养细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:正常早孕期绒毛组织和滋养细胞高表达CD147，不明原因自然流产绒毛组织CD147的mRNA和蛋白表达水平均低于正常早孕期绒毛组织。抗CD147中和性抗体处理原代人滋养细胞后，滋养细胞的增殖能力未发生明显变化，侵袭能力下降。结论:人绒毛组织CD147的异常低表达可能与不明原因早期妊娠失败相关，CD147通过调控滋养细胞的侵袭能力参与正常妊娠的维持。

不明原因自然流产； CD147； 滋养细胞； 细胞增殖； 细胞侵袭

自然流产是指妊娠早期胚胎发育自然终止、丢失的病理过程。排除环境因素，染色体异常，母方生殖道解剖、内分泌、免疫、感染因素和血栓形成倾向，以及父方因素的自然流产称为不明原因自然流产(unexplained spontaneous abortion， USA)。USA在连续发生3次和3次以上反复自然流产人群中的比例高达50%以上，严重影响女性的生殖健康。虽然目前临床上自然流产的治疗和预防取得了很大进展，但其发病机制仍未完全阐明。

CD147是basigin基因表达的一个跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。CD147在许多细胞和组织中表达，参与介导细胞间识别、细胞生长分化以及组织重建等生理过程。研究发现，CD147可以通过肿瘤细胞间的相互作用诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的产生，从而降解基质，促进肿瘤细胞的生长和浸润，因此又被称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)[1]。CD147在多种肿瘤细胞高表达，除激活MMPs外，还可活化多种促炎介质和细胞因子，在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用[2]。

妊娠初期，滋养细胞具有与肿瘤细胞类似的增殖和侵袭行为[3]。大量研究已证实，MMPs在早孕期绒毛组织和蜕膜组织广泛表达，在滋养细胞入侵子宫蜕膜及子宫螺旋动脉重塑中具有重要作用[4]。亦有文献报道，作为MMPs诱导因子的CD147表达于人早期囊胚和足月胎盘[5-6]，子痫前期及子痫患者胎盘组织中CD147表达水平下降[7]。然而目前关于CD147表达与不明原因自然流产的关系并未见报道。本研究通过收集临床标本观察CD147在正常早孕和不明原因自然流产患者绒毛组织中的表达水平，体外分离人早孕期滋养细胞，初步探讨CD147表达水平对滋养细胞增殖和侵袭能力的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人体组织标本的采集 经复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准及患者本人知情同意，绒毛组织取自年龄在25～35岁、孕7～12周自愿行人工流产术终止妊娠的正常妊娠妇女和USA妇女。正常妊娠入选标准为超声检查宫腔内孕囊见原始心管博动，未见盆腔积液；既往无自然流产、死胎、死产史，无遗传、解剖、内分泌方面的异常、感染及抗磷脂综合征。本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征。USA入选标准为超声检查宫腔内见孕囊，未见胚芽或原始心管搏动；既往流产次数≥2次，流产时间为孕7～12周；排除母体染色体、生殖道解剖、内分泌方面的异常，生殖道感染，血栓形成倾向以及男方精液方面的异常。

1.2 主要试剂 MatrigelTMBasement Membrane Matrix 购自BD Bioscience；小鼠抗人CD147单克隆抗体购自Abcam；小鼠抗人细胞角蛋白7(cytokeratin 7，CK7)和波形蛋白(vimentin)单克隆抗体、小鼠IgG、通用ABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒、CD147及GAPDH的引物购自TaKaRa；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液购自杭州碧云天生物科技有限公司；小鼠抗人GAPDH抗体购自Santa Cruz；标记辣根过氧化物酶的羊抗小鼠IgG II 抗购自上海康成生物公司；SuperECL Plus发光液购自Thermo Scientific。

2 方法

2.1 免疫组织化学分析绒毛组织CD147的表达 绒毛组织石蜡切片常规脱蜡、抗原修复、灭活内源性过氧化物、封闭后，滴加小鼠抗人CK7、CD147单克隆抗体及小鼠IgG(1∶50)，4℃孵育过夜；次日按试剂盒说明依次加入生物素化II抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素化生物素反应试剂(ABC法)；DAB避光显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。实验重复5次。

2.2 RT-PCR分析绒毛组织CD147的mRNA转录水平 早孕绒毛组织以预冷的PBS洗涤剪碎后按照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit 进行逆转录。以上述反应所得cDNA为模板进行PCR反应(cDNA 2 μL，Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL，加DEPC水调整反应体系为50 μL)。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，共28个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。CD147的上游引物序列为5’-GACTGGGCCTGGTACAAGATCAC-3’，下游引物序列为5’-GCCTCCATGTTCAGGTTCTCAA-3’，预计扩增产物片段长度为128 bp；GAPDH的上游引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，预计扩增产物片段长度为138 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描成像系统记录产物的电泳结果。用AlphaEase FC软件对RT-PCR产物的电泳条带进行分析。各组CD147与相应GAPDH电泳条带的光密度比值代表其相对表达量。

2.3 Western blotting法分析绒毛组织CD147的表达水平 早孕绒毛组织以预冷的PBS洗涤剪碎后，加入适量RIPA裂解液充分匀浆，冰上放置30 min。经4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清至离心管中，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。取50 μg 蛋白样品加入相应体积的蛋白上样缓冲液，100 ℃变性10 min。12 000 r/min离心5 min 后上样，进行蛋白电泳，转膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，分别加入小鼠抗人CD147单克隆抗体(1∶1 000稀释)、小鼠抗人GAPDH抗体(1∶2 000 稀释)。4 °C孵育过夜后，PBS充分洗涤，加入相应 II 抗(1∶2 000 稀释)，室温孵育1 h，用SuperECL Plus发光液在暗室中压片曝光，显影定影后胶片保存。扫描仪扫描胶片，采用Quantity One分析软件对条带进行密度扫描分析。2.4 滋养细胞的分离与培养 将早孕期正常绒毛组织用含抗生素的PBS充分洗涤、剪碎后采用胰酶消化和密度梯度离心两步法分离、纯化滋养细胞[8]。用此方法分离的滋养细胞经抗角蛋白和抗波形蛋白抗体免疫组织化学方法鉴定，纯度达90%～95%。分离得到的滋养细胞加入含20% 胎牛血清和1%青、链霉素的DMEM-high glucose培养液，种植于预先包被Matrigel的培养板，置于37 °C、5%CO2孵育箱中培养。2.5 免疫细胞化学分析滋养细胞CD147的表达 细胞生长密度约70%时，4%多聚甲醛固定20 min，1% Triton X-100通透细胞膜15 min，3% H2O2孵育15 min以去除内源性过氧化物酶的活性，含3% BSA封闭30 min。弃封闭液后，分别加小鼠抗人CK7、vimentin、HLA-G、CD147单克隆抗体及同型对照小鼠IgG(1∶50)，4 ℃孵育过夜。次日PBS浸泡3～5次后，按ABC试剂盒说明书操作，依次加入生物素化 II 抗、辣根过氧化物酶标记的生物素反应试剂，DAB避光显色，苏木素复染，去离子水返蓝，中性树胶封片，于Olympus倒置显微镜下读片并拍照。胞浆棕褐着色者为阳性细胞，以Image-Pro Plus 6.0软件分析染色强弱。2.6 BrdU掺入法检测滋养细胞增殖 新鲜分离的原代滋养细胞以每孔2×104的密度种植于预先包被Matrigel的96孔板中，经无血清培养液培养12 h同步化后，加入溶媒(PBS)和抗CD147中和性抗体[9-10]。培养48 h后，每孔加入BrdU 20 μL继续培养16 h。固定后每孔依次加入100 μL试剂盒预稀释的BrdU抗体及羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室温孵育，洗板，加入底物显色后经酶标仪读取450和590 nm双波长的吸光度(A)值。每组设5复孔，重复3次。以处理组A值减去其空白对照之差与对照组相应A值差的比值表示增殖指数。

2.7 Transwell侵袭实验检测滋养细胞侵袭 将Transwell小室(8 μm孔径、Corning)滤膜表面包被Matrigel，放入24孔培养板中，于37°C孵箱放置30 min使其凝固，使其形成上、下2个小室。上室加入新鲜分离的原代滋养细胞1×105，在下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培养液。经无血清培养液培养12 h同步化后，加入溶媒(PBS)、抗-CD147中和性抗体[9-10](用含1% 胎牛血清的DMEM配制)。置培养板于37 °C、5%CO2培养箱中孵育48 h，以棉签轻轻拭去上室滤膜内面的细胞，保留定向迁移至滤膜下表面的细胞。甲醇固定，苏木素染色，置显微镜观察，于高倍镜(×200)下每孔随机选择5个视野拍照并计数细胞。独立实验重复3 次。侵袭指数为每高倍镜视野中实验组迁移至下表面的细胞数与对照组迁移至下表面的细胞数的比值。

3 统计学分析

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 15.0进行数据统计分析。应用配对样本t检验(paired-samplet-test)或单因素方差分析(one-way ANOVA)进行2组间或多组间样本均数的比较和统计分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 人正常早孕绒毛组织CD147的表达

对CD147在人正常早孕绒毛组织的表达进行免疫组化验证，可见CK和CD147蛋白阳性染色呈现棕红色，主要分布于细胞滋养层细胞；独特型抗体小鼠IgG并未着色，表明人正常早孕绒毛组织表达CD147，见图1。

Figure 1. The expression of CD147 in human first-trimester villous tissues (×200).

图1 人早孕期绒毛组织CD147的表达

2 CD147在人早孕流产绒毛组织的表达水平

收集早孕期原因不明自然流产和正常妊娠妇女的绒毛组织各5例，分别通过免疫组化、RT-PCR和Western blotting法检测CD147的表达水平。免疫组化结果显示，流产绒毛组织滋养细胞数量明显减少，CD147蛋白的阳性染色颗粒明显减少。RT-PCR实验结果显示，流产绒毛组织CD147的mRNA水平明显低于正常早孕绒毛组织。Western blotting实验结果进一步验证了上述结果，流产绒毛组织的CD147蛋白表达水平较正常早孕绒毛组织明显下降，见图2。

Figure 2. The expression levels of CD147 were lower in the villous tissues from the patients with early unexplained spontaneous abortion than those from the women with normal pregnancies. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal.

图2 CD147在人早孕流产绒毛组织的表达水平下降

3 原代人滋养细胞的鉴定与CD147的表达

原代分离的早孕期滋养细胞在预先包被Matrigel的培养板上呈不规则的多边形，喜迁移、聚集生长。细胞免疫化学结果显示，滋养细胞CK7、HLA-G高强度着色，vimentin不着色，CD147中强度着色,表明人滋养细胞表达CD147,见图3。

Figure 3. The expression of CD147 in the primary human trophoblasts (×200).

图3 原代人滋养细胞CD147的表达

4 CD147抗体处理对原代人滋养细胞增殖和侵袭的影响

为进一步分析CD147是否参与调控滋养细胞的增殖和侵袭行为，我们采用抗CD147中和性抗体封闭CD147的功能，观察原代滋养细胞增殖与侵袭能力的变化。BrdU增殖实验结果显示，抗CD147抗体处理滋养细胞后，细胞的增殖能力没有明显变化。Transwell侵袭实验结果显示，抗CD147抗体处理滋养细胞后，细胞的侵袭能力下降，且呈现浓度依赖趋势，见图4。

Figure 4. The effect of CD147 suppression by CD147 antibody on the proliferation and invasion of primary human trophoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

图4 CD147抗体对原代人滋养细胞增殖和侵袭的影响

讨 论

妊娠初期，滋养细胞的一个重要功能就是入侵母体子宫，以提供胚胎后续发育所需要的各种营养物质。滋养细胞增生活跃，具有侵袭特性，能有效地避免机体免疫系统的攻击，与肿瘤细胞类似，但同时受到机体精细调节系统的严格控制，时间限制在植入窗，空间仅限于子宫内膜和子宫浅肌层。滋养细胞的这种特殊行为对胚胎着床、胎盘发育并建立恰当的母胎关系至关重要。研究表明，滋养细胞和母体细胞可通过细胞表面分子的相互作用，调控母胎界面组成细胞的生物学行为，促进胚胎植入。CD147是细胞表面的跨膜糖蛋白，在介导细胞识别、细胞分化、组织重建等功能中起着重要的作用。CD147可以与多种细胞表面分子相结合，如亲和素蛋白(cyclophilins，CyP)、单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)、小窝蛋白(caveolin 1，Cav-1)等，介导细胞生物学功能[11]。本研究中，我们通过免疫组化检测也证实了CD147在人绒毛组织和原代滋养细胞有较高水平表达，可能参与调节滋养细胞的生物学行为和胚胎着床，与文献报道一致[12]。

胚胎植入是个非常复杂的过程，起始于囊胚与母体子宫内膜黏附，直至胎盘形成。人类胚胎发育到4～6 d 形成囊胚，囊胚外围的扁平细胞即为滋养细胞。人类胚胎在囊胚阶段，CD147的表达上调[5]。早在1998年就有文献报道[13]，CD147基因缺陷的小鼠胚胎绝大部分不能着床，继而死亡；而同期正常小鼠胚胎的滋养层细胞高表达CD147，表明CD147在胚胎发育和植入过程中具有重要作用。但由于人类胚胎标本研究的伦理问题，CD147在人类生殖方面的功能研究鲜有报道。本研究中，我们收集正常早孕和不明原因流产妇女的绒毛组织，通过免疫组化，RT-PCR及Western blotting实验比较CD147在2组人群中的表达差异，结果发现不明原因流产妇女绒毛组织的CD147表达水平较正常早孕妇女显著下降，提示CD147可能参与滋养细胞生物学行为的调控，从而影响妊娠的结局。为了进一步研究CD147表达水平对滋养细胞生物学行为的影响，我们收集正常早孕自愿终止妊娠妇女的绒毛组织，分离培养得到原代滋养细胞，用不同浓度的抗-CD147抗体抑制其生物活性，分析滋养细胞增殖和侵袭能力的变化。实验结果显示，随着抗-CD147抗体浓度的增加，滋养细胞的增殖指数未见明显改变、侵袭指数显著下降，表明CD147参与对滋养细胞侵袭行为的调控。

胚胎成功着床到建立正常母-胎血液循环，需要具有高侵袭力绒毛外细胞滋养细胞首先降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，继而侵袭至蜕膜深部，并向子宫间质及螺旋动脉腔内呈侵袭性生长，取代子宫螺旋动脉血管内皮细胞，协助胎盘血管重铸。MMPs在这个过程中具有重要作用。随着胚胎着床过程的进展，MMPs尤其是MMP-2和MMP-9的表达上调，滋养细胞的侵袭力增加。而CD147能够激活MMPs，在诱导其功能中起着重要的作用[10]。CD147还可以与整合素家族α3β1、α6β1形成蛋白复合物[11]。整合素是广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白，是一个细胞表面受体家族，属于黏附分子大家族，能与其他细胞黏附因子相互作用，也是细胞外基质的主要受体，介导细胞黏附和细胞间信号转导[14]。对于CD147通过何种机制和信号通路调节多种MMPs的表达和活性，进而调控滋养细胞的侵袭行为，我们仍需要进一步的研究来阐明。

综上所述，本文研究发现CD147表达水平下降，可引起滋养细胞侵袭能力下降，进而参与不明原因自然流产的发病过程。不明原因自然流产是妊娠常见的一种并发症，且发病率逐年升高，是导致女性不育的一个重要原因。滋养细胞生物学功能下降是导致自然流产的重要发病机制。因此，深入研究围着床期和孕期CD147分子自身的表达调控以及其对滋养细胞侵袭行为的调控机制，可为胚胎种植失败和自然流产的治疗提供潜在的靶点。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Expression of CD147 in villous tissues of patients with unexplained spontaneous abortion

TANG Chuan-ling1, TENG Xiao-ming1, CHE Ying1, LI Da-jin2

(1FirstMaternityandInfantHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai201204,China;2HospitalofObstetricsandGynecology,FudanUniversity,Shanghai200011,China.E-mail:djli@shmu.edu.cn)

AIM: To analyze the expression levels of CD147 in villous tissues of patients with unexplained spontaneous abortion and to investigate its biological function in human primary trophoblastsinvitro. METHODS: The villous tissues were collected from the women with normal early pregnancy and unexplained spontaneous abortion. The expression levels of CD147 were determined by immunohistochemical staining, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. The primary trophoblasts were prepared by the trypsin-DNase I digestion and culturedinvitro. CD147 expression in the primary trophoblasts was detected by immunocytochemical staining. The primary trophoblasts were treated with anti-human CD147 neutralizing antibody, and then the cell proliferation and invasion abilities were evaluated by BrdU incorporation assay and Matrigel-coated Transwell assay, respectively. RESULTS: CD147 was expressed in the first-trimester villous tissues and human primary trophoblasts. The mRNA and protein levels of CD147 were lower in the villous tissues from the patients with unexplained spontaneous abortion than those from the women with normal pregnancies. The trophoblast invasion decreased significantly accompanied with no evident change in proliferation after treatment with anti-human CD147 neutralizing antibody. CONCLUSION: The abnormal low expression of CD147 in human villous tissues may correlate with early unexplained spontaneous abortion. CD147 plays a role in the regulation of trophoblast invasion and participates in the maintenance of successful pregnancy.

Unexplained spontaneous abortion; CD147; Trophoblasts; Cell proliferation; Cell invasion

1000- 4718(2016)11- 2067- 06

2016- 05- 25

2016- 08- 23

国家自然科学基金资助项目(No. 81300505)；国家卫生和计划生育委员会妇幼司公益性行业科研专项卫生科研专项资助项目(No. 201402004)

R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.025

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 021-63457331； E-mail: djli@shmu.edu.cn