金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎小鼠脾脏Th细胞变化研究①

赵燕清 高 洋 张洪杰 方 琳 陈德坤

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100)



金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎小鼠脾脏Th细胞变化研究①

赵燕清②高 洋 张洪杰 方 琳 陈德坤

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100)

目的：在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎过程中，探讨脾脏内多种Th细胞亚群数量和相关细胞因子、转录因子的动态变化及其意义。方法：本研究首先建立S.aureus感染小鼠的乳腺炎模型，再利用流式细胞术和荧光定量PCR技术，分别检测脾脏中多种Th细胞亚群数量及相关因子mRNA水平。结果：在S.aureus感染小鼠乳房后的不同时间，脾脏内Th2细胞和Th17细胞占CD4+淋巴细胞的比例分别显著增加(P<0.05)，而Treg细胞比例则明显降低(P<0.05)。并且，与Th细胞分化、活化和效应相关的多种细胞因子及转录因子，均在转录水平有明显升高(P<0.05)。结论：乳腺炎不只是发生于乳腺局部的一种炎症反应，机体还能够调动脾脏的多种Th淋巴细胞亚群，以分泌细胞因子的方式，组织有效的乳腺抗S.aureus感染免疫应答。

乳腺炎；Th细胞亚群；脾脏；金黄色葡萄球菌；小鼠

乳腺炎是人和其他多种哺乳动物泌乳期的常见疾病。全球约10%的哺乳期妇女患有乳腺炎[1]，奶牛和奶山羊的乳腺炎发病率分别为10%～74%、9%～50%[2-4]，骆驼、猫、狗、猪和家兔等哺乳动物均有报道患有乳腺炎[5-7]。乳腺炎不仅影响母体健康，还可能通过乳汁将病原菌传递给新生个体使其感染发病甚至死亡。牛羊患乳腺炎不仅泌乳量大大降低，且乳汁及乳制品质量下降。细菌感染是引发乳腺炎的主要原因，最常见的乳腺炎病原菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，其感染常造成临床乳腺炎、隐性乳腺炎和慢性乳腺炎，偶尔引起坏疽性乳腺炎[8]。S.aureus能够形成菌膜并在上皮细胞和巨噬细胞内存活，抗生素疗法不能有效控制S.aureus乳腺炎。目前，针对S.aureus引起的乳腺炎，临床上仍然没有十分有效的预防和治疗方法，关键问题在于乳腺炎免疫应答机制不清楚。本研究首先建立小鼠的S.aureus乳腺炎模型，通过脾脏中多种Th细胞亚群数量及特异性细胞因子mRNA水平的检测，以探讨其在乳腺抗感染免疫中的动态变化意义，为从免疫学角度防治乳腺炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 雌性C57BL/6小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心。自由交配后，取分娩7～10日龄的母鼠建立S.aureus乳腺炎模型。S.aureus是本实验室保存菌株，从临床采集的奶山羊乳腺炎样品中分离得到。

小鼠淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司；RPMI1640培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自Gibco公司；流式抗体FITC anti-CD4 antibody (Ab)、APC anti-CD25 Ab、PE anti-IL-17A Ab、APC anti-IFN-γ Ab、Percp/cy5.5 anti-IL-4 Ab及流式标记缓冲液购自Biolegend公司；总RNA提取试剂RNAiso Plus，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser和荧光染料SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自TaKaRa公司。FACSAria流式细胞仪购自BD Biosciences公司；iQ5荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 建立小鼠乳腺炎模型S.aureus复壮培养后，挑取单克隆菌落接种至LB液体培养基扩大培养6 h。3 500 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬后平板菌落计数法计数CFU(Colony-forming units)。将S.aureus调整为4 × 107CFUs/ml菌体悬液，用于小鼠乳房注射。

为使乳房充盈乳汁，将分娩7～10日龄的母鼠与仔鼠分别饲养。1～2 h后，氯胺酮(100 mg/kg体重)腹腔注射，麻醉母鼠。75%酒精消毒母鼠腹部。将母鼠第四对乳房分别注射4 × 106CFUs/0.1 mlS.aureus悬液。在细菌感染6 h，将仔鼠放回，与母鼠共同饲养。设置对照组为麻醉后仅PBS缓冲液注射乳房的哺乳期母鼠。

1.2.2 病理组织学观察 分别在S.aureus感染乳房的1、3、5和7 d，脱颈椎处死小鼠。无菌解剖小鼠，观察乳腺局部病理变化。摘取一侧乳腺，4%多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片，苏木精-伊红染色后光学显微镜进行病理组织学的观察分析。

1.2.3 分离小鼠脾脏淋巴细胞 无菌摘取小鼠脾脏，研磨后200目不锈钢筛网过滤。将单细胞悬液叠加于等体积淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min。吸取中间云雾层的淋巴细胞，PBS洗涤两次，重悬于含10%胎牛血清的完全1640培养基。调整细胞密度为1 × 106个/ml，备用。

1.2.4 流式细胞术检测 在布雷菲德菌素A(10 μg/ml)存在时，以佛波酯(50 ng/ml)和离子霉素(1 μg/ml)共同刺激已经制备的脾脏淋巴细胞悬液，5%CO237℃培养6 h。收集并离心洗涤细胞一次，重悬于细胞标记缓冲液中，与FITC anti-CD4 Ab和APC anti-CD25 Ab室温避光孵育20 min，进行细胞表面分子染色标记。经细胞固定及破膜后，将脾脏淋巴细胞与PE anti-IL-17A Ab、APC anti-IFN-γ Ab和Percp/cy5.5 anti-IL-4 Ab室温避光共孵育20 min，进行细胞内分子染色标记。经细胞标记缓冲液洗涤并重悬，上机，流式细胞仪检测。设置同型阴性对照抗体为对照组。

1.2.5 荧光定量PCR检测多种细胞因子mRNA表达 无菌采集小鼠脾脏，研磨，RNAiso Plus裂解细胞后，经氯仿-异丙醇法分离得到总RNA。将1 μg 总RNA按照反转录试剂盒说明书制备为cDNA。按照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明书，进行PCR反应。反应体系为：SYBR Mix 10 μl、cDNA 4 μl、上下游引物各0.4 μl、ddH2O 5.2 μl。反应条件为：95℃ 5 min，40个循环(95℃ 15 s、58℃ 30 s)或95℃ 5min，40个循环(95℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 20 s)。以2-ΔΔCt表示试验数据。Real-time PCR引物见表1。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism软件进行统计学分析，并作图。对照组和试验组数据运用一维方差分析或t检验进行差异分析，以P<0.05为差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺炎模型小鼠组织病理学测定结果 病理解剖显示，对照组小鼠乳腺乳汁充盈，质地均一(见图1A)。试验组小鼠乳腺呈蜂窝状，有局限性脓液积聚(见图1B)。病理组织切片显示，S.aureus感染小鼠乳腺组织退化萎缩，腺泡壁增厚，腺泡上皮增生，上皮细胞排列紊乱甚至脱离基底膜进入腺泡腔。中性粒细胞和淋巴细胞侵入腺泡腔(见图1D)。结果表明，成功建立了小鼠乳腺炎模型。

2.2 Th1细胞及相关细胞因子、转录因子的检测结果 与对照组比较，脾脏Th1细胞(CD4+IFN-γ+)占CD4+淋巴细胞比例在S.aureus感染乳腺的3 d略有增加，IFN-γ mRNA在S.aureus感染乳房的5 d略有上升(P>0.05)。Th1细胞特异性转录因子T-bet mRNA在S.aureus感染乳房的3、5 d显著增加；促进Th1细胞分化并活化的细胞因子IL-12 mRNA在细菌感染乳房的3、5和7 d明显增加(P<0.05，图2)。

表1 Real-time PCR所用引物及扩增片段大小

Tab.1 Primers and respective amplified product size used for Real-time PCR

GeneGenBankaccessionNoSequence(5′⁃3′)Ampliconsize(bp)Reference2⁃stepPCRGapdhNM＿008084F：ACCTGCCAAGTATGATGAC119[9]R：GGGAGTTGCTGTTGAAGTIl17NM＿010552F：CTCCAGAATGTGAAGGTC89[9]R：GAACGGTTGAGGTAGTCTIl1bNM＿008361F：GAATCTATACCTGTCCTGTGTAA130R：GCTCTTGACTTCTATCTTGTTGIl12aNM＿001159424F：AACGCAGCACTTCAGAAT108R：CAGAGTCTCGCCATTATGATIl6NM＿031168F：AGAAGGAGTGGCTAAGGA187R：GAGAACAACATAAGTCAGATACTbx21NM＿019507F：ACCAGAGCGGCAAGTGGG69[10]R：TGGACATATAAGCGGTTCCCTGTgfb1NM＿011577F：TGACGTCACTGGAGTTGTACGG169[11]R：GGTTCATGTCATGGATGGTGCIl10NM＿010548F：AAGGACCAGCTGGACAACAT172[12]R：TCTCACCCAGGGAATTCAAACCR6NM＿009835F：GGTTCATCTCCATCATCATCT81R：GCTCACAGACATCACGATIl4NM＿021283F：TCAACCCCCAGCTAGTTGTC199[13]R：CGAGCTCACTCTCTGTGGTGRorcXM＿005357024F：CCGCTGAGAGGGCTTCAC241[14]R：TGCAGGAGTAGGCCACATTACA3⁃stepPCRIfngNM＿008337F：ATCTGGAGGAACTGGCAAAA246[13]R：TGAGCTCATTGAATGCTTGGIl23aNM＿031252F：AGCGGGACATATGAATCTACTAAGAGA244[15]R：GTCCTAGTAGGGAGGTGTGAAGTTG

图1 小鼠乳腺解剖及组织切片观察(×40)Fig.1 Representative appearance of murine mammary gland(×40)Note: A.Mammary gland of healthy mice；B.S.aureus infected mice;C.Histological section of mammary gland from healthy mice；D.S.aureus infected mice;Arrows in figure B indicate abscesses,and arrow in figure D indicates neutrophil.

2.3 Th2细胞及相关细胞因子的检测结果 与对照组比较，脾脏Th2细胞(CD4+IL-4+)占CD4+淋巴细胞比例在S.aureus感染乳房的1 d显著增加，在1 d 后递减。IL-4 mRNA在细菌感染乳房的5 d明显高于正常对照组(P<0.05，图3)。

2.4 Th17细胞及相关细胞因子、转录因子的检测结果 脾脏Th17细胞(CD4+IL-17+)占CD4+淋巴细胞比例在S.aureus感染乳房的3 d显著增加(P<0.05)。Th17细胞特异性的转录因子RORγt mRNA在细菌感染乳房的5 d显著升高(P<0.05)，但促炎性细胞因子IL-17 mRNA在细菌感染乳房的5 d显著低于正常对照组(P<0.05)。与Th17细胞分化、活化相关的细胞因子，如TGF-β、IL-6和IL-1β，分别在细菌感染乳房的不同时间显著增加转录的mRNA(P<0.05)。虽然细胞因子IL-23也参与Th17细胞活化，促进IL-17产生，但是试验组与对照组在转录水平比较无明显差异。此外，CCR6是表达于Th17细胞膜表面、与Th17细胞的趋化募集有关的蛋白，本研究脾脏中CCR6 mRNA在S.aureus感染乳腺的5 d显著高于对照组(P<0.05)。见图4。

图2 被感染小鼠脾脏中Th1细胞占CD4+淋巴细胞比例与相关细胞因子、转录因子mRNA水平的动态变化Fig.2 Dynamics of proportion of Th1 cells in CD4+ lymphocytes and mRNA expression of Th1-related cytokines and transcription factor in spleen of infected mice

图4 被感染小鼠脾脏中Th17细胞占CD4+淋巴细胞比例与相关细胞因子、转录因子mRNA水平的动态变化Fig.4 Dynamic change of proportion of Th17 cells in CD4+ lymphocytes and mRNA expression of Th17-related cytokines and transcription factor in spleen of infected mice

图3 被感染小鼠脾脏中Th2细胞占CD4+淋巴细胞比例与IL-4 mRNA水平的动态变化Fig.3 Dynamics of proportion of Th2 cells in CD4+ lymphocytes and IL-4 mRNA expression in spleen of infected mice

图5 被感染小鼠脾脏中Treg细胞占CD4+淋巴细胞比例与IL-10 mRNA水平的动态变化Fig.5 Dynamics of proportion of Treg cells in CD4+ lymphocytes and IL-10 mRNA expression in spleen of infected mice

2.5 Treg细胞数量及分泌细胞因子的检测结果 与对照组比较，脾脏Treg细胞(CD4+CD25+)占CD4+淋巴细胞比例在S.aureus感染乳房的3、5和7 d显著降低(P<0.05)。而IL-10 mRNA在S.aureus感染乳房的5 d显著高于对照组(P<0.05，图5)。

3 讨论

脾脏是机体最重大的外周免疫器官，也是适应性免疫应答发生的主要场所。脾脏内定居着大量成熟的T淋巴细胞，其中的Th细胞在接受抗原肽-MHC复合物刺激后，当细胞因子微环境合适时，能够分别分化为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞[16]，然后迁移至病原体所在部位，执行清除病原体的免疫功能。通常机体被病原体感染后，脾脏Th细胞数量和亚群比例首先会发生显著变化，这种变化也基本反映了机体免疫系统对特定病原体感染的防御机制。因此，要研究机体抗御病原感染的免疫机理，有必要搞清楚脾脏T细胞，尤其是Th细胞的数量和所占比例在炎症过程中的变化。基于此，本研究探讨乳腺抗S.aureus感染的免疫机制，首先对脾脏的Th细胞亚群变化进行了测定。本研究结果显示，小鼠乳腺感染S.aureus一周内的不同时间段， Th2和Th17亚群比例明显升高，与其分化相关的细胞因子mRNA水平也显著升高，提示Th2和Th17亚群可能是乳腺抗S.aureus感染的主要效应T细胞亚群，Th1亚群可能也参与了这一免疫应答，但它可能处于辅助者的地位。

Th17细胞以分泌IL-17为特征，介导炎症反应，在多种自身免疫病和清除寄生虫、胞内细菌感染过程中发挥重要作用[17]。Th17细胞是否参与乳腺炎特别是S.aureus引起的乳腺炎尚不清楚。本研究揭示，脾脏Th17细胞占CD4+淋巴细胞的比例在S.aureus感染乳房的3 d显著增加，促进Th17细胞发育分化的细胞因子TGF-β、IL-6和IL-1β在mRNA转录水平明显升高，介导Th17细胞产生IL-17的重要转录因子RORγt mRNA明显增加。这表明S.aureus感染乳房后，脾脏中成熟Th细胞向Th17细胞发生了明显的分化。但与此变化不一致的是脾脏IL-17 mRNA含量明显减少。我们推测，脾脏产生的Th17细胞尚未分化成Th17效应细胞，受趋化因子影响募集至乳腺组织后，才能够转化为大量分泌IL-17的效应Th17细胞。与这一假设相一致的是，我们的检测结果表明，促进Th17细胞活化分泌IL-17的细胞因子IL-23 mRNA转录水平没有显著变化，而与Th17细胞趋化募集相关的细胞表面受体CCR6 mRNA在S.aureus感染乳房的5 d明显增加。并且，已有研究报道称，S.aureus感染乳房引起乳腺炎后，IL-17 在乳腺组织腺泡、乳导管、乳池、乳头管和乳汁内的mRNA转录水平及蛋白水平显著增加[18-20]。验证这一假设，需要开展进一步的研究。

Th1/Th2是经典的辅助性T细胞亚群，Th1细胞介导细胞免疫，而Th2细胞在体液免疫中发挥重要作用。本研究结果表明，Th2细胞而非Th1细胞占CD4+淋巴细胞的比例在S.aureus感染乳房后显著增加，细胞因子IL-4而非IFN-γ mRNA转录水平明显升高，揭示体液免疫而非细胞免疫在乳房抗S.aureus感染免疫应答中发挥重要作用。但是，促进Th1细胞发育分化的细胞因子IL-12及其关键转录因子T-bet，在S.aureus感染乳房的3、5 d显著增加转录表达，意味着Th1细胞发育分化可能是发生在S.aureus感染乳房的炎症后期，继而募集至乳腺局部发挥清除胞内细菌的作用。S.aureus是兼性胞内寄生菌，在上皮细胞和巨噬细胞内存活，由Th1细胞介导的细胞免疫可能是机体彻底清除S.aureus感染的重要途径。

Treg细胞被认为是免疫应答的负调节者。本研究结果表明，脾脏中Treg细胞占CD4+淋巴细胞的比例在S.aureus感染乳房的3 d后显著降低，暗示对T淋巴细胞分化活化的抑制作用减弱，提示机体增强了抗S.aureus感染免疫应答的炎症反应。脾脏中抑炎性细胞因子IL-10 mRNA的显著升高，可以解释为由Th2细胞产生，适当抑制炎性反应，避免因过度炎症反应而造成组织病理性损伤。已有研究报道，IL-10能够严格地调控IL-17产生，进而控制中性粒细胞的募集，调节机体发挥有效的免疫保护作用而非造成免疫病理性损伤[21]。

综上所述，乳腺炎并不只是发生于乳腺局部的一种炎症反应，机体还能够调动脾脏的多种辅助性T淋巴细胞亚群，以分泌细胞因子的方式，组织有效的乳腺抗S.aureus感染免疫应答。

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[收稿2016-01-25 修回2016-03-07]

(编辑 倪 鹏)

Dynamics of T helper cell subsets in spleen in a murine Staphylococcus aureus mastitis model

ZHAO Yan-Qing,GAO Yang,ZHANG Hong-Jie,FANG Lin,CHEN De-Kun.

College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China

Objective:To study the dynamics of T helper cell subsets and related cytokines and transcription factors and its significance in spleen in mice during experimentally inducedStaphylococcusaureusmastitis .Methods: We firstly established a murine mastitis model by challenge with an inoculum ofStaphylococcusaureus,and then,the number of each T helper cell subset and the mRNA level of their associated factors were assessed in spleen by flow cytometry and quantitative real-time PCR,respectively.Results: At the indicated time points afterStaphylococcusaureusinfection,the proportion of Th2 cells and Th17 cells in CD4+lymphocytes were significantly increased,respectively,whereas,the proportion of regulatory T cells was significantly decreased (P<0.05).Moreover,the mRNA expression of genes encoding cytokines and transcription factors involved in the differentiation and function of various T helper cells,was greatly elevated in spleen (P<0.05).Conclusion: Mastitis is not only a local inflammation of the mammary gland,but also involved in various T helper cell subsets in spleen via pro-inflammatory cytokine production to mediate effective immune responses againstStaphylococcusaureusinfection in mastitis.

Mastitis;T helper cell subsets;Spleen;Staphylococcusaureus;Mouse

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.004

①本文受陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTTSNY04-04)资助。

赵燕清(1986年-)，女，博士，讲师，主要从事感染与免疫及分子免疫学方面研究，E-mail：zhaoyq619@163.com。

及指导教师：陈德坤(1964年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事预防兽医学与分子免疫学方面研究，E-mail：chendekun163@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)11-1583-06

②湖北医药学院基础医学院，十堰 442000。