过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2基因多态性与冠心病易感性及血脂水平的关系研究

蒋健刚 兰景良 杜晓马

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2基因多态性与冠心病易感性及血脂水平的关系研究

蒋健刚 兰景良 杜晓马

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2（PPAR-γ2）基因Pro12Ala及C161T位点单核苷酸多态性与金华市汉族人群冠心病易感性及血脂水平的关系。方法采用聚合酶连反应-限制性片段长度多态性方法对263例冠心病患者和207例健康体检者进行PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位点单核苷酸多态性检测，并探讨基因多态性对冠心病发生及血脂水平的影响。结果Pro12Ala位点多态性检测显示，两组间基因型分布及等位基因频率差异均无统计学意义（均P＞0．05），在冠心病组中Ala等位基因携带者TC和LDL-C水平均高于非携带者（均P＜0．05）。C161T位点多态性检测结果显示，基因型和等位基因频率在两组间分布差异均无统计学意义（均P＞0．05）；两组T等位基因携带者TG水平低于非携带者（P＜0．05）。结论PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位点基因多态性可能与金华地区汉族人群冠心病发生无关，但Pro12Ala位点的Ala等位基因可能影响冠心病患者TC和LDL-C水平，C161T位点的T等位基因可能影响人群TG水平。

冠心病 血脂 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2 基因多态性

冠心病严重危害人类健康，其病因和发病机制复杂，目前尚不完全清楚，但普遍认为是由遗传和环境等多种因素共同作用所致[1]。研究证实，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）具有很强的血脂调节能力，可能与代谢综合征、2型糖尿病及动脉粥样硬化等疾病的发生和发展密切相关[1-4]。尽管有研究表明PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位点多态性与冠心病发生及血脂水平有相关性，但在不同研究中所得出的结果也不尽一致[1-4]。本研究拟采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFKP）检测金华地区汉族人群PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位点多态性，探讨其与本地区汉族人群冠心病遗传易感性及血脂水平的相关性，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2013年8月至2015年8月在金华市中医医院就诊和住院的冠心病患者263例为冠心病组，其中男179例，女84例，年龄47～73（61.32±7.54）岁。入选同期性别、年龄等临床资料相匹配的体检者207例为对照组，其中男124例，女83例，年龄45～76（60.18±8.71）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。冠心病诊断参考WHO制定的缺血性心脏病诊断标准[5]。所有入选者在入选时均详细询问病史和体格检查，完善各项检查项目，并排除神经精神类疾病、肿瘤、感染性疾病、肝肾功能不全、风湿免疫性疾病、妇科疾病及不愿参加者。所有入选人员均无血缘关系且在本地区居住3代以上，均知情同意，并签署志愿同意书。

1.2 方法

1.2.1 血压及生化指标检测 采用电子血压计测量所有入选者在安静状态下上臂的血压，取3次的平均值。所有入选者均在清晨禁食8h以上后抽取外周静脉血10ml：5ml置于EDTA抗凝管中，用于提取基因组DNA；另外5ml用于测定血浆TG、TC、HDK-C及KDK-C等生化指标。

1.2.2 基因组DNA提取 于-20℃保存备用。引物设计参考文献[6-7]：Pro12Ala位点所用引物序列为：P1：5＇-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3＇；P2：5＇-GAT ATG TTT GCA GAC ATG GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G-3＇。C161T位点所用引物序列为：P1∶5＇-CAA GAC ACC CTG CTA CAA GC-3＇；P2：5＇-TCC TTG TAG ATC TCC TGC AG-3＇。PCR反应体系为50μl，10× buffer 5μl，上下游引物各1μl，dNTPs（10mmol/K）2μl，基因组DNA 2μl，Taq plus DNA聚合酶2μl，ddH2O 37μl。Pro12Ala位点PCR反应条件为95℃ 4min；95℃45s，55℃45s，72℃30s，进行35个循环；72℃5min。C161T位点反应条件为 95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃60s，进行35个循环；72℃7min。反应结束后取2μl反应产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行EB电泳检测。PCR扩增产物分别用HpaⅡ和EcoR72Ⅰ限制性内切酶消化。产物用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳（100V，30min），电泳后在紫外凝胶成像仪下拍照，根据酶切产物片段的组合型来判断基因型。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，两组比较采用t检验；研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组对象血压及生化指标比较 见表1。

表1 两组对象血压及生化指标比较

由表1可见，两组对象的舒张压和TG差异无统计学意义（均P＞0.05），冠心病组的收缩压、TC及KDK-C高于对照组，HDK-C低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型检测结果 Pro-12Ala位点目标基因片段长267bp，根据酶切后片段长度不同分为3种基因型：PP型，包含224bp和43bp两个片段；PA型，包含267bp、224bp和43bp 3个片段，43bp未显示；AA型，只含267bp 1个片段，详见图1。

2.3 PPAR-γ2基因C161T位点基因型检测结果 C161-T位点目标基因片段长200bp，根据酶切后片段长度不同分为3种基因型：CC型，包含120bp和80bp两个片段；TC型，包含200bp、120bp和80bp 3个片段；TT型，只含200bp1个片段，详见图2。

图1 PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型检测结果

2.4 两组Pro12Ala及C161T位点基因型及等位基因频率分布比较 对照组PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明对照组具有良好的群体代表性。各组间基因型及等位基因频率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表2。

图2 PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型检测结果

表2 两组对象Pro12Ala及C161T位点基因型及等位基因频率分布[例（%）]

2.5 两组对象PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型与血脂的关系 由于AA基因型较少，因此将PA型和AA型合并成Ala等位基因型携带者进行分析，见表3。

表3 两组对象PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型与血脂的关系（mmol/K）

由表3可见，冠心病组的Ala等位基因携带者TC及KDK-C水平高于非携带者（均P＜0.05），但在对照组中两亚组差异无统计学意义（均P＞0.05）。两组TG及HDKC水平在两亚组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 两组对象PPAR-γ2基因C161T位点基因型的血脂比较 由于TT基因型较少，所以将CT型和TT型合并为T等位基因携带者进行分析，见表4。

表4 两组对象PPAR-γ2基因C161T位点基因型的血脂比较（mmol/K）

由表4可见，两组对象的T等位基因携带者TG水平均低于非携带者（均P＜0.05），而TC、HDK-C、KDK-C水平在两亚组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

PPAR-γ是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白质，其主要生理作用为促进脂肪细胞合成并抑制脂肪细胞分解，对血脂代谢有很强的调节作用。PPAR-γ基因主要由脂肪细胞表达，可以对脂肪的存贮和释放进行调控，维持人体的能量代谢平衡，对血糖和胰岛素抵抗有调节作用，还参与血管的炎性反应和动脉的粥样硬化过程[1-4]。人类的PPAR-γ基因位于染色体3p25上，含有9个外显子和3个启动子，根据5＇端的剪切方式不同分为3种亚型：γ1、γ2、γ3[6]。其中γ2有两种常见的单核苷酸基因位点突变，分别是B外显子Pro12Ala的替换和第6个外显子C161T的突变[8]。

PPAR-γ2基因Pro12Ala基因型与冠心病及血脂的关系在不同的研究中结果也不尽相同。Ki等[9]研究发现Pro12Ala基因型与冠心病发病有相关性，其多态性对冠心病发生可能有保护作用，但与血脂变化无明显相关性；而Rhee等[10]研究认为PPAR-γ2基因Pro12Ala基因型与冠心病发生不存在相关性，而与血脂变化有关。在本研究中我们针对浙江省金华市汉族人群中PPAR-γ2基因Pro12Ala位点基因型进行了研究，结果显示在对照组中PP型占72.95%、PA型占23.19%、AA型占3.86%，此结果与陈娟等[10]研究结果相似。在冠心病组与对照组中PP、PA、AA3种基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义，提示Ala等位基因可能不是金华地区汉族人群冠心病发生的易感基因。在本研究中冠心病组的PA+AA型患者血浆TC及KDK-C水平较PP型患者高，而在对照组未观察到类似的改变。可能的原因是[11]：Pro12Ala基因可能与体内脂蛋白脂酶（KPK）的活性相关，PPAR-γ2基因作为转录因子主要参与脂质储存和代谢的基因调控，Ala等位基因携带使得PPAR-γ2转录因子活性降低，相应的KPK活性也下降，TC的清除量也减少，致使患者血浆TC和KDK-C水平升高；而对于健康携带者而言，Ala等位基因携带者血脂也有与冠心病患者相似的变化趋势，但是差异无统计学意义，可能是Ala等位基因的携带仅仅使KPK活性降低，对血脂的影响较小而未表现出明显的差异。Wang等[12]对647例澳大利亚冠心病人群研究结果表明，PPAR-γ2基因C161T位点的T等位基因携带者冠心病发生率低于CC基因型者；而Wan等[2]研究得出相反结论，认为PPAR-γ2基因C161T位点基因型与冠心病遗传易感性无明显相关性，但可能对冠心病患者的血脂有影响。本研究发现，金华地区汉族人群中C161T位点在冠心病组和对照组间基因型和等位基因频率分布均无明显差异，提示T等位基因可能不是金华地区汉族人群冠心病发生的易感基因，这与Wan等[2]的研究结果相似。在本研究中观察到，无论是冠心病组还是对照组，C161T位点的T等位基因携带者血浆TG水平均明显低于非携带者，提示T等位基因携带可能可以降低血浆TG水平，这与Tavares等[13]研究结果相似。

本研究结果显示，PPAR-2γ基因 Pro12Ala及C161T位点的不同基因型均未发现与冠心病的发生有相关性，但均在一定程度上影响血脂水平。因本研究只是个局部区域的小样本队列研究，尚不能说明PPAR-γ2基因是否是冠心病发病的独立影响因素以及对血脂的影响，尚需要更大规模更多区域的相关性研究进行证实。

（致谢：感谢金华职业技术学院医学院提供的技术支持！）

[1] Rhee E J,Kwon C H,Lee W Y,et al．No association of Pro12Ala polymorphism of PPAR-gamma gene with coronary artery disease in Korean subjects[J]．Circ J,2007,71(3):338-342．

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（本文编辑：马雯娜）

《浙江医学》对计量单位的要求

本刊执行GB 3100～3102-1993《量和单位》中有关量、单位和符号的规定及其书写规则，具体执行可参照中华医学会杂志社编写的《法定计量单位在医学上的应用》。注意单位名称与单位符号不可混用。组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时应采用负数幂的形式表示，组合单位中斜线和负数幂亦不可混用，如ng/kg/min应采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在叙述中应先列出法定计量单位数值，括号内写旧制单位数值；如果同一计量单位反复出现，可在首次出现时注出法定与旧制单位换算系数，然后只列法定计量单位数值。血压仍以mmHg表示。

本刊编辑部

Association of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 2 variants with coronary heart disease

JIANG Jiangang. LAN Jingliang. DU Xiaoma. Department of Cardiology. Jinhua TCM Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicat University. Jinhua 321017. China

ObjectiveTo explore the association between peroxisome proliferator activated receptor-gamma 2 (PPAR-γ2)variants and risk of coronary heart disease(CHD)in Jinhua Han populations．MethodsA total of 263 patients with CHD and 207 healthy controls were recruited．The Pro12Ala and C161T polymorphisms of PPAR-γ2 gene were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)．The association of Pro12Ala and C161T polymorphisms of PPAR-γ2 gene with CHD and plasma lipid levels was analyzed．ResultsNeither the frequencies of genotypes nor frequencies of alleles of Pro12Ala polymorphisms of PPAR-γ2 gene was statistically different between CHD group and control group(P＞0．05),but subjects with PA/AA genotypes had a higher plasma mean concentration of TC and LDL-C compared with those with the PP genotype in the CHD group(P＜0．05)．There were also no significant differences in the distribution of C161T genotypes and alleles between CHD and control groups(P＞0．05),but subjects with CT/TT genotypes had a lower plasma mean TG concentration than those with CC genotype(P＜0．05)．ConclusionThere may be no association between PPAR-γ2 gene Pro12Ala and C161T polymorphisms with CHD in Jinhua Han population,but the CHD patients who had PA/AA genotypes of Pro12Ala polymorphisms may have higher plasma levels of TC and LDL-C,and people who had CT/TT genotypes of C161T polymorphisms may have lower plasma level of TG．

Coronary heart disease Plasma lipid Peroxisome proliferator-activated receptors-gamma 2 Genepolymorphism

2015-09-24）

321000 浙江中医药大学附属金华中医院心内科

蒋健刚，E-mail：jjg2009768@163.com