FTY720对颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡的抑制作用

蔡建勇 林群 巴华君 陆川 陈献东 陈茂华 孙军

●论 著

FTY720对颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡的抑制作用

蔡建勇 林群 巴华君 陆川 陈献东 陈茂华 孙军

目的 探讨FTY720对颅脑损伤大鼠海马组织神经细胞凋亡的抑制作用。方法 30只大鼠随机分成假手术组、模型组和治疗组，每组10只，采用改进的Feeney自由落体损伤装置建立大鼠颅脑损伤模型，假手术组大鼠切开头皮，颅骨钻孔后缝合头皮，不作外力打击。治疗组大鼠按1mg/kg剂量予FTY720腹腔注射，其他组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液1ml。24h后断头处死大鼠，分离海马组织，采用TUNEL法检测凋亡神经细胞，Western-blotting检测pro-caspase 3/9蛋白表达，四肽荧光底物法检测caspase-3/9蛋白活性。结果 模型组大鼠海马组织凋亡神经细胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表达和caspase-3/9蛋白活性较假手术组显著升高，而治疗组大鼠海马组织凋亡神经细胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表达和caspase-3/9蛋白活性较模型组显著下降。结论 FTY720可显著抑制颅脑损伤大鼠海马组织神经细胞凋亡，具有脑保护作用。

FTY720 大鼠 神经细胞凋亡 脑保护作用

免疫反应是颅脑损伤后继发性脑损伤机制的重要组成部分[1]。FTY720是一种新型的免疫抑制剂，是将冬虫夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I进行结构改造而成的，在体内代谢为具有生物活性的物质而发挥作用。其免疫抑制具有双向调节作用，在体内抑制免疫反应发生的同时不破坏机体对病毒的免疫应答及免疫记忆能力，不良反应少，生物利用度高[2]。目前，FTY720用于治疗多发性硬化症已进入Ⅱ期临床试验，治疗肾移植排斥反应已进入Ⅲ期临床研究阶段[3]。笔者采用FTY720腹腔注射治疗大鼠颅脑损伤，观察其对大鼠海马组织神经细胞凋亡的抑制作用，从而评价其脑保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（中国科学院上海实验动物中心），体重250～300g，雄性，清洁级；FTY720（美国Biovision公司）临用时根据1mg/kg用量以0.9%氯化钠溶液配成1ml注射液；TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；caspase-3/9蛋白活性检测试剂盒（美国Livemore公司）；小型垂直电泳槽（型号：164-8001，美国Biorad公司）；转印槽（型号：Trans-Blot，美国Biorad公司）；脱色摇床（型号：TY-80B，常州澳华仪器有限公司）；电泳仪（型号：EPS-200，上海天能科技有限公司）；低温高速离心机（型号：BECKMAN，北京普瑞麦迪实验室技术有限公司）。

1.2 方法 将30只大鼠随机分成假手术组、模型组和治疗组，每组10只。予50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后，在右侧冠状缝后1mm、中线旁开2mm处切开头皮，钻一直径5mm骨孔，采用改进的Feeney自由落体损伤装置，用40g重的击锤从25cm处自由坠落冲击撞杆，打击深度5 mm，缝合头皮。假手术组大鼠切开头皮，颅骨钻孔后缝合头皮，不作外力打击。假手术组和模型组大鼠手术操作完成前或模型形成前0.5h予0.9%氯化钠注射液1ml腹腔注射，治疗组大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg剂量予FTY720腹腔注射；24h后，大鼠以80 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，断头处死，分离海马组织。

1.3 细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测大鼠海马组织凋亡神经细胞，细胞核染色呈棕黄色或棕红色定义为细胞染色阳性，在Olympus-CH光学显微镜下计算10个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，总计1 000个细胞，计算平均凋亡率（%）。

1.4 pro-caspase 3/9蛋白的检测 采用Western-blotting检测大鼠海马组织pro-caspase 3/9蛋白的表达。取部分组织按1∶10（密度：体积）加入细胞裂解液，冰上匀浆，13 000 g离心20min收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白（20～50μg）经12%SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST室温封闭1h；加入相应山羊抗大鼠一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入HRP标记的兔抗大鼠二抗（1∶10 000）室温摇床孵育1h，TBST洗膜3次；ECL试剂作用5min，X光胶片曝光。冲洗并扫描后结果用quality one软件分析杂交条带灰度值，以GAPDH水平为内对照，比较相对灰度值。

1.5 caspase-3/9蛋白活性的检测 采用四肽荧光底物法检测caspase-3/9蛋白活性。取脑组织匀浆100μl与caspase-3底物AC-DEVD-AMC和caspase-9底物ACLEHD-AFC混合反应，采用荧光分光光度计测定其荧光强度，以未加脑组织时的荧光强度为参照值，计算荧光强度，最终比较相对荧光强度。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较应用单变量方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 FTY720对神经细胞凋亡的影响 假手术组神经细胞凋亡率为（7.1±1.7）%，模型组为（23.5±3.2）%，治疗组为（16.7±2.3）%，假手术组大鼠海马组织神经细胞凋亡率不高，模型组大鼠海马组织神经细胞凋亡率显著升高，而治疗组大鼠海马组织神经细胞凋亡率较模型组显著下降（均P＜0.001），详见图1。

图1 FTY720对神经细胞凋亡的影响（TUNEL法，×100）

2.2 FTY720对pro-caspase 3/9蛋白表达的影响 颅脑损伤后，大鼠海马组织pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表达明显增加，使用FTY720后，这些蛋白表达明显回调（均P＜0.001），详见图2和表1。

2.3 FTY720对caspase 3/9蛋白活性的影响 颅脑损伤后，大鼠海马组织caspase 3和caspase 9蛋白活性明显增加，使用FTY720后，这些蛋白活性明显下降（均P＜0.001），详见表2。

3 讨论

颅脑损伤发生率高，预后不佳。颅脑损伤后脑组织局部免疫应答增强加重脑组织的继发性脑损伤[1]，为临床应用免疫抑制疗法治疗颅脑损伤提供一定的实验依据。但另一方面，临床上颅脑损伤患者有50%～70%合并继发性感染，而应用常规免疫抑制剂可致全身免疫功能低下，加重继发性感染[4]。因此寻找一种安全有效的免疫抑制剂对于减少颅脑损伤后继发性脑损伤具有重要意义。

图2 FTY720对pro-caspase 3/9蛋白表达的影响

表1 FTY720对pro-caspase 3/9蛋白表达的影响

FTY720是一种新合成的免疫抑制剂，为鞘氨醇-1-磷酸盐（S1P）受体阻滞剂[5]。在细胞内FTY720被鞘氨醇激酶2磷酸化为具有生物活性的（S）-FTY720-P异构体而发挥作用。（S）-FTY720-P与5种1-磷酸鞘氨醇受体中的S1P1、S1P4、S1P5有高的亲合力，与S1P3有低的亲合力，不与SlP2结合。根据1-磷酸鞘氨醇受体亚型和靶细胞/组织的不同，FTY720功能表现为拮抗或激动[6]。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反应，还可以用于治疗皮炎、重症肌无力等免疫紊乱/障碍疾病及某些转移性癌症[7]。

pro-caspase 3和pro-caspase 9是凋亡蛋白caspase 3和caspase 9的无活性前体形式，当受到凋亡信号刺激后，会酶解成caspase 3和caspase 9活性二聚体形式。其中蛋白caspase 3为凋亡执行者，可直接降解胞内结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡；而caspase 9是凋亡启动者，受到凋亡信号刺激后，caspase 9自剪接激活，引起caspase级联反应[8-10]。目前动物实验中FTY720用于脑损伤治疗的剂量均选用1mg/kg，且一般在脑损伤动物模型形成前短时间内腹腔或静脉注射使用[11-13]。既往动物研究证实神经细胞凋亡一般在脑损伤后24～72h达到高峰[8-10]，且有关FTY720用于脑损伤治疗的研究也一般选择在脑损伤后24h进行神经功能评价和脑组织取样[11-13]。基于以上因素，本研究在脑外伤模型形成前短时间（0.5h）内采用1mg/kg FTY720腹腔注射治疗脑损伤大鼠，且神经细胞凋亡检测的时间选择在外伤后24h。本实验检测颅脑损伤后大鼠海马神经细胞凋亡、procaspase 3和pro-caspase 9蛋白表达和caspase 3和caspase 9蛋白活性后发现，颅脑损伤后pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表达增加，caspase 3和caspase 9蛋白活性增强，且凋亡神经细胞比例增高，表明颅脑损伤后脑内发生凋亡；给予FTY720处理后，神经细胞凋亡、pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表达和caspase 3和caspase 9蛋白活性表现出不同程度的回调，显示FTY720可降低颅脑损伤后凋亡的发生。最近有研究显示，FTY720可抑制体外培养胶质细胞的炎性因子释放[14]，阻止脑外伤大鼠外伤皮层炎性细胞的聚集，从而降低脑炎症反应[15]。FTY720可以抑制动物脑出血后脑内淋巴细胞浸润[11]，也能有效抑制短暂性脑缺血导致的大鼠神经细胞死亡[12]和降低脑出血大鼠脑水肿，改善脑功能[13]。也有研究发现，FTY720用于治疗脑缺血后大鼠的同时并没有提高机体的细菌感染率[16]。目前，少有研究揭示FTY720对颅脑损伤后神经细胞凋亡及caspase 3/9通路的影响，本研究揭示了FTY720对颅脑损伤大鼠神经细胞凋亡的抑制作用。既往研究提示FTY720可显著抑制中枢神经系统炎症反应[14－15]。因此，笔者推测FTY720可能通过抑制脑炎症反应，从而抑制神经细胞凋亡，改善颅脑损伤导致的神经功能障碍，而且安全可靠。然而，药效往往与用药时间和用药剂量密切相关，本研究没有进一步分析不同剂量FTY720和不同时间点用药对神经细胞凋亡的抑制作用，这方面的数据需要今后深入研究。

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Inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis of neurons in rats with experimental traumatic brain injury

CAI Jianyong,LIN Qun, BA Huajun,et al.Department of Neurosurgery,Wenzhou Central Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis in hippocampus of rats with experimental traumatic brain injury. Methods Thirty rats were randomly divided into sham-operation group,model group and treatment group with 10 in each.Modified Feeney free fall injury device was used to induce craniocerebral injury in rats of model and treatment groups.Rats in sham-operation group underwent scalp incision,cranial drilling and scalp suture,but no traumatic impact.Rats in treatment group were administrated intraperitoneally with 1 mg/kg FTY720.Rats in other two groups were given an intraperitoneal injection of 1 mL normal saline.After 24 hours,rats were sacrificed by decapitation and their hippocampus tissues were dissected.TUNEL staining,Western-blotting and four peptide fluorescence substrate method were used to determine the apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins,respectively. Results Compared with sham-operation group,the percentage of apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins were significantly elevated in the hippocampus of model group;while these indicators in treatment group were significantly lower than those of model group. Conclusion FTY720 can markedly suppress cell apoptosis of hippocampus neurons in rats after trauma brain injury and shows cerebral protective effect.

FTY720 RatNeuronalcellapoptosis Cerebralprotective effect

2015-11-21）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省实验动物科技计划项目（2014C37029）

325000 温州市中心医院神经外科

蔡建勇，E-mail：cjy19761976@126.com