二苯乙烯苷对小鼠心肌肥厚作用的研究

张 蒙，董 苗，周暄宣，魏仁吉，王玉玲，李步潆，于立明，翟蒙恩，金振晓，段维勋，王四旺

·基础研究·

二苯乙烯苷对小鼠心肌肥厚作用的研究

张 蒙，董 苗，周暄宣，魏仁吉，王玉玲，李步潆，于立明，翟蒙恩，金振晓，段维勋，王四旺

目的 探讨二苯乙烯苷（TSG）对皮下注射异丙肾上腺素（ISO）引起的C57小鼠心肌肥厚的治疗作用。方法 40只雄性C57小鼠（20～25 g）随机分为4组（每组n＝10）：Sham组、TSG（120 mg／kg）组、ISO造模组和TSG＋ISO组，采用皮下注射ISO制备心肌肥厚模型。给药结束后对各组小鼠进行超声检查检测心脏收缩功能，并测量心脏重量／体重（HW／BW）、肺脏重量／体重（LW／BW）等大体指标。应用HE染色检测各组小鼠心肌平均横截面积的变化。应用PCR技术检测ANP、α－MHC、β－MHC基因表达水平，Western blot检测ANP、α－MHC、β－MHC蛋白表达水平。结果 与Sham组比较，ISO组左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）显著降低，HW／BW、LW／BW明显增大，心肌平均横截面积显著增大，而TSG（120 mg／kg）组的各项指标均无显著变化；与ISO组比较，TSG＋ISO组的LVEF、LVFS显著升高，HW／BW、LW／BW明显减小，心肌平均横截面积显著降低；与Sham组比较，ISO组的ANP和α－MHC的表达水平显著升高，β－MHC的表达水平显著降低。与ISO组比较，TSG＋ISO组中的ANP和α－MHC的表达水平显著降低，而β－MHC的表达水平显著升高。结论 TSG可以减轻ISO诱导的心肌肥厚，对心脏具有保护作用。

二苯乙烯苷；心肌肥厚；异丙肾上腺素

心肌肥厚是引起心血管疾病发病率和死亡率显著升高的重要独立危险因素，是高血压性心脏病、心脏瓣膜病、心力衰竭等许多心血管疾病共有的病理过程，就高血压而言，我国高血压患者约2亿人，调查发现大约有20%～40%的高血压患者存在心肌肥厚。持久的心肌肥厚将导致心肌耗氧量增加、心肌供血不足、心室顺应性降低、心脏射血量下降，最终可引起心率失常、心衰［1－3］。临床上虽然已有多种治疗心肌肥厚的策略，但心肌肥厚导致的心衰发病率和病死率仍居高不下。因此，探寻新的有效治疗药物对于防治心肌肥厚及其并发症具有重大临床意义。

二苯乙烯苷（2，3，5，4′－Tetrahydroxystilbene－2－O－β－D－Glucoside，TSG）为白色无定形粉末，易溶于水、甲醇及乙醇，分子量为406．39［4］，是何首乌中特有的生物活性成分，其含量已成为何首乌药材的专属性标志，具有良好的水溶性，同时TSG具有抗氧化清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、神经保护等多种药理活性［5－6］。此外，TSG也在心血管疾病中发挥了重要的保护作用，如抑制心肌纤维化、减轻心肌缺血再灌注损伤、延缓动脉粥样硬化进展等［7－9］，但 TSG能否抵抗心肌肥厚国内外尚缺乏报道。

本实验拟通过皮下注射异丙肾上腺素（Isoprot⁃erenol，ISO）建立小鼠心肌肥厚模型，以观察TSG对心肌肥厚的影响。

1 材料与方法

1．1 材料 雄性C57小鼠40只，体重20～25 g，均由第四军医大学实验动物中心提供。TSG（由第四军医大学药物研究所自制，纯度为98．5%），异丙肾上腺素（sigma公司），戊巴比妥钠（sigma公司）。Ve⁃vo770小动物超声仪（加拿大VisualSonics公司）。抗ANP、β－MHC抗体（Santa cruz公司），抗α－MHC抗体（Abcam公司），抗GAPDH抗体（北京中杉公司）。

1．2 方法

1．2．1 实验动物分组及给药 将40只成年雄性C57小鼠随机分为4组：①Sham组、②TSG组、③ISO组、④ISO＋TSG组，每组10只。根据课题组前期预实验，TSG浓度30 mg／kg、60 mg／kg、120 mg／kg、200 mg／kg中，120mg／kg的效果最佳并作为TSG给药剂量。根据文献报道［10－11］，ISO造模组和TSG＋ISO组皮下多点给予5 mg／（kg·d）ISO，连续7 d，Sham组和TSG组皮下给予等体积生理盐水，且皮下注射ISO均在灌胃给药1 h前进行。TSG组和TSG＋ISO

组于ISO开始注射前，提前7 d灌胃TSG，ISO注射后继续给药7 d，共计14 d。Sham组和ISO组给予相应体积生理盐水灌胃。

1．2．2 心功能检测 利用Vevo770小动物超声仪检测并计算左室射血分数（left ventricular ejectional fraction，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）等心功能的变化。心脏超声检测前，需将小鼠麻醉后脱除胸部与上腹部毛发。小动物心脏超声检测步骤：小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，直至刺激鼠尾反应消失，将小鼠固定于37℃恒温超声检测台；调节麻醉机异氟烷吸入浓度，使小鼠心率稳定在400～500次／min；记录M型超声图像；并分析LVEF、LVFS［12］。

1．2．3 心脏重量（heartweight，HW）、肺脏重量（lung weight，LW）和体重（body weight，BW） 称量超声检测结束后，称量每只小鼠的BW并记录，然后处死取心脏和肺脏，称量HW和LW并记录。取心尖部分心肌组织约20 mg，－80℃冻存，用于心肌肥厚相关基因表达水平的检测，其余组织用于蛋白表达水平的检测。

1．2．4 心脏HE染色 超声检测结束后，留取部分心脏组织进行HE染色，具体步骤如文献所述［13］。

1．2．5 心肌肥厚相关基因表达水平的检测 将冻存的心肌组织放入组织研磨器中，加入500μl Trizol试剂并在冰上研磨，室温静置5min。加入100μl氯仿震荡30 s，室温静置3 min，以4℃，10 000 g离心10min。取上清，加入250μl异丙醇室温静置10 min，以4℃，9 000 g离心10min。弃上清，加入50μl 75%的乙醇后，以4℃，10 000 g离心5 min，弃上清，在冰上静置片刻，加入30μl无RNA酶水以溶解RNA。提取的mRNA通过Nanodrop2000系统检测RNA的浓度和纯度。将mRNA逆转录为cDNA。通过RT－PCR技术检测各种基因表达情况。RT－PCR反应条件为95℃5 min预热；95℃30 s；55℃30 s，72℃30 s，共30个循环。引物设计如下：

1．2．6 心肌肥厚相关蛋白表达水平的检测 将样本心肌组织提蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度并进行蛋白定量，经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白，用湿转法将蛋白转移到PVDF膜，用50 g／L脱脂牛奶封闭后，TBST洗脱3次，每次10 min，将对应条带放入（1：500）的ANP、α－MHC和β－MHC抗体，4℃过夜，TBST洗脱3次，分别加1：5 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，TBST洗脱3次，每次10 min，使用ECL－plus试剂盒发光，通过生化检测系统成像并分析结果，以GAPDH作为内参照，检测各蛋白的表达情况。

1．3 统计学处理 采用Prism 5．0软件进行统计学分析，实验结果数据均以±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），若总体差异显著，再以t检验分析相应两组间的显著性差别。以P＜0．05表示有统计学差异。

2 结 果

2．1 心脏超声检测 各组小鼠超声心动图显示（图1A），与Sham组相比，TSG组心功能未明显变化（P＞0．05），ISO组心功能显著下降（P＜0．01）；与ISO组相比，TSG＋ISO组LVEF（图1B）与LVFS（图1C）显著提高（P＜0．01）。

2．2 肥厚参数 药物干预14 d后，Sham组和单用TSG组的HW／BW、LW／BW没有显著差异；ISO组的HW／BW、LW／BW比正常对照组显著升高（P＜0．01）；与 ISO组相比，TSG＋ISO组的 HW／BW、LW／BW显著降低（P＜0．01），见图1D、图1E。此外，通过HE染色评估各组小鼠心肌平均横截面积的变化，ISO处理14 d后，小鼠心肌平均横截面积较正常对照组显著升高（P＜0．01）；与ISO组相比，TSG＋ISO组心肌平均横截面积显著降低（P＜0．01），见图1F、图1G。

图1 四组小鼠给药后心脏功能、心体比、肺体比与心肌平均横截面积（×200）

2．3 心脏肥厚相关基因标志物表达水平测定 与Sham组比较，ISO组ANP和β－MHC的表达水平均明显上调（P＜0．01），而α－MHC的表达水平下调；与ISO组比较，TSG＋ISO组的ANP和β－MHC的表达水平下调，而α－MHC的表达水平上调；正常对照组与TSG组比较无显著差异，见图2A、图2B、图2C。

2．4 心脏肥厚相关蛋白标志物表达水平测定Western blot检测结果显示，与Sham组相比，ISO组ANP和β－MHC的蛋白表达水平显著升高，而α－MHC的蛋白表达水平降低；正常对照组和单用TSG组相比无统计学差异。TSG＋ISO组ANP和β－MHC的表达水平显著低于ISO组，而α－MHC的表达水平显著高于ISO组，见图2D、图2E、图2F。

图2 心肌肥厚标志分子基因和蛋白水平表达情况

3 讨 论

心肌肥厚主要由于心脏长期压力负荷过重，导致心肌总量增加，收缩力增强，以维持正常的心脏功能而产生的一种代偿反应。长期应激导致的持续性病理性心肌肥厚可发展为心脏扩大、充血性心力衰竭和猝死。心肌肥厚与多种心血管疾病发展过程有关，是心肌缺血、心律失常和心性猝死的独立危险因素［14－15］。目前临床上常用的药物有血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin－converting enzyme inhibitor，ACEI）类药物、钙离子通道阻滞剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂。这三类药物均可减轻肥厚心肌重量，然而其副作用也较大，例如干咳、血管性水肿、低血压综合征、晕厥、眩晕、头痛与面部潮红等［16－17］。这些副作用一定程度上限制了其临床应用，因此，探寻新的副作用小的有效治疗药物具有重大临床意义。TSG是何首乌中特有的生物活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、神经保护等多种药理作用，是目前研究的热点。进一步研究发现，TSG对心肌缺血再灌注损伤、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、动脉粥样硬化等心血管系统疾病同样具有防治作用［7－9，18－22］，这就为TSG抗心肌肥厚，起到保护心脏的作用提供了可能，有望发现一种新的抗心肌肥厚药物。

本试验在以ISO诱导心肌肥厚小鼠模型的基础上，探讨TSG对心肌肥厚发生发展的作用。实验结果显示：与ISO组比较，TSG＋ISO组的HW／BW、LW／BW、心脏超声结果、肥厚相关基因和蛋白的表达均有明显改善，提示TSG可以减轻ISO诱导的心肌肥厚，对心脏具有保护作用。

肌球蛋白是参与心肌兴奋－收缩耦联的重要组成部分，其重链分为α－MHC和β－MHC两种亚型［23－24］。研究发现，胚胎期心脏主要表达β－MHC，出生后心脏中β－MHC的含量逐渐降低，而α－MHC的含量则逐渐升高。成年心脏中以α－MHC表达为主，β－MHC表达极少［25］。发生该现象的原因是α－MHC较β－MHC拥有更高的ATPase活性，可以更快地利用ATP为肌肉收缩提供能量。但是在多种病理情况下，如病理性心肌肥厚发生时，α－MHC的表达会出现明显下降，而β－MHC的表达则明显增高，α－MHC／β－MHC比例明显降低，出现胚胎期肌球蛋白重链表型。多项研究证实，α－MHC／β－MHC比例的倒置，提示心肌肥厚预后不良，是心衰、心源性猝死等严重心血管并发症的预警标志［26］。本研究发现，ISO处理后心肌组织中β－MHC的表达（蛋白和基因水平）会急剧增高，同时伴随有α－MHC表达的降低，而给予TSG可显著逆转病理性心肌肥厚标志性分子改变——α－MHC／β－MHC比例倒置。此外，还发现，TSG可显著逆转ISO诱导的ANP表达上调，进一步证实TSG可能具有抵抗ISO诱导的心肌肥厚作用，但是其具体机制还需进一步研究证实。心肌肥厚的发病机制复杂，可能存在多个通路之间的相互作用和影响，随着对心肌肥厚治疗新靶点的研究和探索，有望发现TSG抗心肌肥厚作用的潜在机制，为心肌肥厚的预防和治疗提供新策略。

［1］ Scimia MC，Hurtado C，Ray S，etal．APJactsasa dual receptor in cardiac hypertrophy［J］．Nature，2012，488（7411）：394－398．

［2］ Creemers EE，Pinto YM．Molecular mechanisms that control in⁃terstitial fibrosis in the pressure－overloaded heart［J］．Cardiovasc Res，2011，89（2）：265－272．

［3］ Wen C，Wu L，Ling H，et al．Salutary effects of Corydalis yan⁃husuo extract on cardiac hypertrophy due to pressure overload in rats［J］．JPharm Pharmacol，2007，59（8）：1159－1165．

［4］ 徐杰，周文聪，张媛英．何首乌活性成分——二苯乙烯苷的研究进展［J］．泰山医学院学报，2008（1）：78－80．

［5］ 谢岚．何首乌及二苯乙烯苷的研究进展［J］．天津药学，2010（3）：70－73．

［6］ Zhang W，Wang CH，Li F，et al．2，3，4＇，5－Tetrahydroxystilbe⁃ne－2－O－beta－D－glucoside suppressesmatrix metalloproteinase expression and inflammation in atherosclerotic rats［J］．Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35（3）：310－316．

［7］ Zhang W，Chen XF，Huang YJ，etal．2，3，4＇，5－Tetrahydroxys⁃tilbene－2－O－beta－D－glucoside inhibits angiotensin II－induced cardiac fibroblast proliferation via suppression of the reactive oxy⁃gen species－extracellular signal－regulated kinase 1／2 pathway［J］．Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39（5）：429－437．

［8］ Ye S，Tang L，Xu J，et al．Postconditioning＇s protection of TH⁃SG on cardiac ischemia－reperfusion injury and mechanism［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（1）：13－16．

［9］ Han X，Ling S，Gan W，etal．2，3，5，4＇－tetrahydroxystilbene－2－O－beta－d－glucoside ameliorates vascular senescence and im⁃proves blood flow involving amechanism of p53 deacetylation［J］．Atherosclerosis，2012，225（1）：76－82．

［10］ 徐清斌，袁娅妮，王洋，等．氧化苦参碱抑制异丙肾上腺素诱导心衰大鼠心肌肥厚及对血清ET－1及NO的影响［J］．中成药，2014（11）：2390－2393．

［11］ Krenek P，Kmecova J，Kucerova D，etal．Isoproterenol－induced heart failure in the rat is associated with nitric oxide－dependent functional alterations of cardiac function［J］．Eur JHeart Fail，2009，11（2）：140－146．

［12］ Tao L，Wang Y，Gao E，et al．Adiponectin：an indispensable molecule in rosiglitazone cardioprotection followingmyocardial in⁃ farction［J］．Circ Res，2010，106（2）：409－417．

［13］ Lu J，Liu F，Liu D，et al．Amlodipine and atorvastatin improved hypertensive cardiac hypertrophy through regulation of receptor ac⁃tivator of nuclear factor kappa B ligand／receptor activator of nu⁃clear factor kappa B／osteoprotegerin system in spontaneous hyper⁃tension rats［J］．Exp Biol Med（Maywood），2016，241（11）：1237－1349．

［14］ Kucukler N，Kurt IH，Topaloglu C，etal．The effectof valsartan on left ventricular myocardial functions in hypertensive patients with left ventricular hypertrophy［J］．JCardiovasc Med（Hagers⁃town），2012，13（3）：181－186．

［15］ Banerjee I，Avatapalle B，Petkar A，et al．The association of cardiac ventricular hypertrophy with congenital hyperinsulinism［J］．Eur JEndocrinol，2012，167（5）：619－624．

［16］ Vidt D G．Telmisartan，ramipril，or both in patients at high risk for vascular events［J］．Curr Hypertens Rep，2008，10（5）：343－344．

［17］ Russell R P．Side effects of calcium channel blockers［J］．Hyper⁃tension，1988，11（3 Pt 2）：I42－I44．

［18］ 甘受益，李彩蓉，曾令勇，等．二苯乙烯苷上调SIRT1蛋白防治心肌缺血再灌注损伤［J］．湖北科技学院学报（医学版），2014（3）：188－190．

［19］ 张韶辉，郭珩，邓体瑛，等．二苯乙烯苷对多柔比星致心肌细胞凋亡的保护作用［J］．中国药事，2014（12）：1357－1360．

［20］ 张伟，王春华，沈燕，等．二苯乙烯苷对实验性大鼠动脉粥样硬化的治疗作用［J］．中国药科大学学报，2007（3）：261－264．

［21］ Zhao J，Liang Y，Song F，et al．TSG attenuates LPC－induced endothelial cells inflammatory damage through notch signaling in⁃hibition［J］．IUBMB Life，2016，68（1）：37－50．

［22］ Ye S，Tang L，Xu J，et al．Postconditioning＇s protection of TH⁃SG on cardiac ischemia－reperfusion injury and mechanism［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（1）：13－16．

［23］ Hang CT，Yang J，Han P，et al．Chromatin regulation by Brg1 underlies heart muscle development and disease［J］．Nature，2010，466（7302）：62－67．

［24］ van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al．Control of stress－de⁃pendent cardiac growth and gene expression by amicroRNA［J］．Science，2007，316（5824）：575－579．

［25］ Weiss A，Leinwand LA．Themammalianmyosin heavy chain gene family［J］．Annu Rev Cell Dev Biol，1996，12：417－439．

［26］ James J，Martin L，Krenz M，et al．Forced expression of alphamyosin heavy chain in the rabbit ventricle results in cardioprotec⁃tion under cardiomyopathic conditions［J］．Circulation，2005，111（18）：2339－2346．

2，3，5，4′－Tetrahydroxystilbene－2－O－β－D－G lucoside protects hearts from iso⁃proterenol－induced cardiac hypertrophy in m ice

Zhang Meng，Dong Miao，Zhou Xuan－xuan，Wei Ren－ji，Wang Yu－ling，Li Bu－ying，Yu Li－ming，ZhaiMeng－en，Jin Zhen－xiao，Duan Wei－xun，Wang Si－wang
Institute ofMaterial Medical，School ofPharmacy，The Fourth Military Medical University，Xi＇an，China；Department ofCardiovascular Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China；

Objective To explore the anti－cardiac hypertrophy（induced by isoproterenol）effect of 2，3，5，4′－Tetrahydroxys⁃tilbene－2－O－β－D－Glucoside（TSG）in C57BL／6mice．M ethods Forty C57BL／6micewere random ly divided into four groups（n＝10 in each group）：Sham group；TSG；ISO；ISO＋TSG．We created themouse cardiac hypertrophymodel through subcutaneous injection of isoproterenol（5mg／kg per day，for 1 week）．Echocardiography was used to determine cardiac function．HW／BW and PW／BW were used tomeasure the degree of cardiac hypertrophy．HE stainingwas used tomeasure themean cross－sectional area of cardiomyocytes in each group．RT－PCR and Western blotting were used to determine themRNA and protein levels of ANP，α－MHC andβ－MHC．Re⁃sults TSG treatment significantly improved the cardiac functional recovery and reduced HW／BW，LW／BW and themean cross－sec⁃tional area of cardiomyocytes．Additionally，TSG treatmentsignificantly reduced the expression of themRNA and protein levels of ANP，andβ－MHC，while improved the expression of themRNA and protein levels ofα－MHC．Conclusion Our results shows that TSG pos⁃sesses cardioprotective effects against isoproterenol－induced cardiac hypertrophy inmice．

TSG；Cardiac hypertrophy；Isoproterenol

2016⁃05⁃26）

2016⁃06⁃02）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．年．期．流水号

陕西省科技统筹创新工程计划项目（2012KTCQ03－02）；陕西省科技统筹创新工程计划项目（2016TZC－S－14－3）；陕西省国际科技合作与交流计划项目（2015KW－047）；陕西省社会发展公关计划（2015SF104）；西京医院学科助推计划（XJZT14203，XJGX12C11，XJGX13LC15）

710032西安，第四军医大学天然药物研究所（张 蒙、周暄宣、王四旺）；第四军医大学学员旅（董 苗、王玉玲、魏仁吉）；第四军医大学第一附属医院心血管外科（李步潆、于立明、翟蒙恩、金振晓、段维勋）；

王四旺，Email：wangsiw＠fmmu．edu．cn；

段维勋，Email：duanweixun＠126．com