D-核糖诱导人肌红蛋白快速非酶糖基化

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(1.南华大学医学院，湖南 衡阳 421001；2.南华大学蛋白质结构与功能实验室；3.南华大学化学化工学院)

·基础医学·

D-核糖诱导人肌红蛋白快速非酶糖基化

游咏1,2,刘芳1,2,高淑琴1,2，林英武2,3,文格波1,2*

(1.南华大学医学院，湖南 衡阳 421001；2.南华大学蛋白质结构与功能实验室；3.南华大学化学化工学院)

目的探讨D-核糖与D-葡萄糖对人肌红蛋白(HMb)分子构象的影响，并研究反应后晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成情况，以期为糖尿病及其并发症的防治提供新的研究线索。方法表达、纯化获得HMb，在体外分别与D-核糖及D-葡萄糖共孵育，采用紫外可见光谱(UV-vis)监测反应后HMb的结构变化，利用荧光光谱法监测反应后AGEs的生成情况。通过SDS-PAGE观察HMb与D-核糖及D-葡萄糖反应后分子量的变化情况。结果UV-vis显示D-核糖可在短时间内导致HMb血红素活性中心构象发生改变，且呈时间依赖性；同时随着核糖糖化时间的延长，具自发荧光的AGEs生成也逐渐增多。SDS-PAGE结果显示D-核糖能很快地与HMb发生反应，形成高分子量多聚体。而在相同的反应条件下，D-葡萄糖对HMb构象的影响及AGEs的形成显著较D-核糖为弱。

核糖； 葡萄糖； 肌红蛋白； 非酶糖基化

据国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation，IDF)统计，糖尿病患者数量正在全球迅速增加，2013年全球糖尿病患者数量达3.82亿人，预计到2035年，这一数字将达到5.92亿[1]。临床研究表明，糖尿病的并发症是其致死致残的主要原因[2-3]。糖尿病患者体内血糖长期高水平促使蛋白质非酶糖基化反应(Non-enzymatic glycation)速度明显增快，可诱导各种并发症的发生[4-5]。有研究发现，2型糖尿病大鼠的尿核糖以及血液中的核糖含量均显著升高[6]，且核糖能快速地诱导蛋白质如α-突触核蛋白(α-Synuclein)等非酶糖基化的发生[7]。因此，进一步研究核糖糖基化可能为糖尿病的诊治提供新的线索。肌红蛋白(myoglobin，Mb)由一条多肽链(153 个氨基酸残基)和一个血红素( heme) 辅基组成。Mb与血红蛋白(hemoglobin，Hb)均为以血红素为辅基的蛋白，其主链与Hb的α链和β链的折叠形成的三维结构非常相似，而关于Hb发生非酶糖基化后形成的糖化血红蛋白(Hemoglobin A1C，HbA1C)的研究，目前已比较深入[8-9]。Mb主要存在于诸如骨骼肌，心肌及平滑肌等肌肉细胞中，但当这些细胞受损后Mb可迅速进入血液循环，与血液中的糖类发生非酶糖基化反应，使其结构与功能发生变化，加重糖尿病的并发症。之前本文作者的研究也证实葡萄糖可以通过氢键与Mb相互作用，从而影响其过氧化物酶活性[10]。而关于核糖对Mb的影响目前鲜有报道。本研究旨在通过体外实验，研究D-核糖或D-葡萄糖与Mb共孵育后，对Mb构象的影响，以及是否形成晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)，从而为糖尿病及其并发症的防治提供新的研究途径。

1 材料与方法

1.1材料人肌红蛋白(human myoglobin，HMb)的cDNA由日本奈良先端科学技术大学院大学(Nara Institute of Science and Technology，NAIST ) Shun Hirota教授馈赠。D-核糖(Sigma)，D-葡萄糖(Sigma)及其他的所有化学试剂都为国产分析纯。

1.2仪器F-7000FL型荧光分光光度计(日本HITACHI公司)，U Agilent 8453紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技公司)，HERA THERM incubator 恒温培养箱(Thermo 公司)。

1.3方法

1.3.1 HMb的表达与纯化 按文献所述的方法[11]，以大肠杆菌BL21(DE3)菌株作为pET29B质粒的表达宿主，采用CaCl2法制备大肠杆菌感受态后转化，通过测序确定正确后，进行扩大培养至OD600值为0.5～0.6，加入IPTG 诱导4 h，离心并收集沉淀，超声破菌1 h后再次离心收集上清液超滤，加入DEAE阴离子交换柱，收集蛋白溶液加入少量铁氰化钾再次超滤后加入凝胶层析柱，使用100 mmol/L磷酸盐缓冲液进行层析；最后，通过UV-vis 光谱，收集ASoret/A280 >4.0 的蛋白溶液进行浓缩，浓缩至1 mL 左右，保存于-20 ℃冰箱备用。离心、层析及超滤均在4 ℃进行。

1.3.2 HMb的体外糖化 在终浓度为100 μmol/L 的HMb溶液中，分别加入终浓度为0.5 mol/L的D-核糖及D-葡萄糖，过0.22 μmol/L微孔滤膜滤器过滤除菌，置于在37 ℃恒温共孵育7天，在相同条件下，以不加糖的HMb溶液作为对照。工作溶液为20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。

1.3.3 HMb非酶糖基化的紫外可见光谱(UV-Vis)变化

采用紫外可见分光光度计检测HMb非酶糖基化后的光谱变化，通过监测位于409 nm处Mb的特征性Soret吸收峰与280 nm吸收峰的比值，可以了解非酶糖基化对蛋白血红素活性中心构象的影响。分别于HMb与还原糖孵育的第0，1，3，5，7天取样，用20 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释50倍，测定UV-Vis。

1.3.4 HMb非酶糖基化的荧光光谱变化 蛋白质如果发生非酶糖基化，生成的AGEs会产生自发性荧光，通过测定荧光产物的变化情况，可了解AGEs的生成情况。分别于HMb与还原糖孵育的第0，1，3，5，7天取样，用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释10倍。测定蛋白质内源荧光(λex=325 nm；λem=410 nm)，同时选择激发光波长为λex= 325 nm ，进行发射光谱扫描300～500 nm。扫描速度为1 200 nm/min，激发和发射狭缝分别为5 nm，10 nm，PMT voltage：500 V，温度25 ℃，每个数据为3次测量的平均值。

1.3.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 由于蛋白质发生非酶糖基化后会增加被修饰蛋白的分子量，通过SDS-PAGE可以观察到蛋白因分子量变化而产生的滞后现象。利用这一特性，对HMb的体外糖化修饰进行鉴定。分别于孵育第0～7天的各组样品20 μL 按4∶1 比例与5×还原型上样缓冲液混合,95 ℃ 5 min变性后上样，取10 μL混悬液进行SDS-PAGE电泳。电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色，甲醇—冰醋酸脱色后观察结果。

2 结 果

2.1 HMb的表达与纯化血红素蛋白，如Mb、Hb、细胞色素c(Cytochrome c)等，具有非常特征的紫外-可见光谱(UV-Vis)，在409 nm左右有特征吸收，称为Soret峰，而在500～600 nm可见区域也存在特征性吸收峰ɑ、β峰。Soret峰和ɑ、β峰能反映出血红素中心铁的氧化还原态及配位状态，其变化可作为判断血红素活性中心构象改变的重要依据。而在280 nm 吸收强度与峰型可以反映出蛋白质分子中芳香性氨基酸Trp、Tyr和Phe残基的数量及所处的微环境。本实验获得的HMb也具有血红素蛋白特征性的紫外-可见光谱(UV-Vis)：除280 nm吸收外，可见Soret吸收峰以及ɑ、β峰(图1)，说明蛋白质分子折叠完好，能行使正常的蛋白质功能。

图1 人肌红蛋白(human myoglobin，HMb)的紫外—可见光谱图

2.2 D-核糖及D-葡萄糖与HMb反应后UV-Vis变化血红素蛋白Soret峰的变化可反应出其结构的改变。将HMb分别与0.5 mol/L的D-核糖及D-葡萄糖，共孵育7天，通过UV-Vis光谱检测发现：HMb与D-核糖共孵育后随着核糖化时间的延长，Soret峰显著降低，而280 nm吸收峰逐渐增高，说明HMb核糖糖基化后，会导致血红素辅基从蛋白肽链中逐渐解离，导致蛋白分子内的芳香性氨基酸残基逐渐暴露(图2a)。与D-葡萄糖共孵育组对照，后者也有相似的改变，但至共孵育后第7天Soret峰稍有下降，此反应远不及D-核糖组明显(图2b)。因此，通过UV-Vis的监测提示，HMb与D-核糖共孵育后，HMb的分子构象已经发生了明显的变化。

2.3 D-核糖及D-葡萄糖与HMb反应后荧光光谱的变化蛋白质在发生非酶糖基化后，若形成AGEs则可产生新的荧光衍生物，在320 nm左右的激发光下，产生410 nm发射波长的特定荧光[12]。为了判断HMb体外能否发生非酶糖基化形成AGEs，本实验将D-核糖及D-葡萄糖分别与HMb溶液共孵育7天后，取反应后1、3、5、7天的混合溶液，在325 nm激发光下，进行300～500 nm区间荧光扫描。本文作者观察到D-核糖与HMb共孵育后第1天，在410 nm左右就出现了一个新的荧光发射峰，其荧光强度随着HMb反应的时间延长逐渐增高(图3a)。而在7天内，与D-葡萄糖共孵育组却未见明显的变化(图3b)。因此，实验证明D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地诱导HMb发生非酶糖基化，产生的AGEs呈时间依赖性增加。

图2 人肌红蛋白(human myoglobin，HMb)与D-核糖(a)/D-葡萄糖(b)共孵育后UV-Vis光谱变化 (RMb，D-核糖与肌红蛋白共孵育组；GMb，D-葡萄糖与肌红蛋白共孵育组)

2.4糖与HMb反应后SDS-PAGE检测HMb与其他种属Mb最大的区别在于，其存在一个特有的氨基酸，即110位的半胱氨酸(Cysteine，Cys)。单Cys的存在，会使得蛋白质分子之间会通过二硫键形成二聚体。SDS-PAGE显示，HMb存在两个条带，与预染蛋白分子量标准对比，上一条带分子量是下一条带的两倍，因此提示分别为HMb的单体(Monomer)与二聚体(Dimer)。HMb分别与D-核糖/D-葡萄糖共孵育后0～7天，进行SDS-PAGE电泳。图4a为HMb与D-核糖共孵育组，结果显示：孵育第1天，即可见单体分子量的条带位置稍有上移，自反应后第2天起，随着核糖化时间的延长，单体分子量的蛋白条带逐渐减少，而出现了逐渐增多的拖尾现象，可见较大分子量的区域条带渐增。图4b为HMb与D-葡萄糖共孵育组，也出现了类似于D-核糖组的条带变化趋势，但明显较D-核糖延迟，说明D-葡萄糖相比于D-核糖，影响较小，与UV-vis光谱的结果一致。

图3 人肌红蛋白(human myoglobin，HMb)与D-核糖 (a)/D-葡萄糖(b)共孵育后荧光光谱变化 (RMb，D-核糖与肌红蛋白共孵育组；GMb，D-葡萄糖与肌红蛋白共孵育组)

图4 人肌红蛋白(human myoglobin，HMb)与D-核糖(a)以及与D-葡萄糖(b)共孵育SDS-PAGE

3 讨 论

蛋白质的非酶糖基化修饰会改变蛋白质的结构与性质，使得其难以被蛋白酶降解，甚至发生交联，导致一系列的功能障碍，而蛋白质糖化后AGEs的生成与聚集不仅加速了糖尿病病程的发展，也与糖尿病慢性并发症的发生与发展有着密切的关系。现研究已经证实Hb的非酶糖基化产物HbA1C与糖尿病慢性并发症的发生直接相关[13-15]。Mb与Hb有着极其相似的三维结构和功能，这也为Mb非酶糖基化研究提供了理论依据。2004年首次报道，Mb可与葡萄糖发生非酶糖基化反应[16]。随后的研究发现，Mb还可与诸如果糖，非糖类中间产物丙酮醛(Methylglyoxal，MG)等发生非酶糖基化反应，改变Mb的空间构象，进而影响Mb的氧释放、过氧化物酶等多种生物学功能的发挥[17-21]。Mb作为重要的氧载体以及具有多重生物学效应的蛋白，非酶糖基化后对其影响，还存在很大的研究空间。人Mb与其他物种Mb的最大区别在于其存在一个特有的氨基酸，即Cys110，后者的存在会导致蛋白质形成二聚体，这种特殊的结构是否影响蛋白的非酶糖基化，目前尚无报道，本课题组就这一方面也正在研究之中。

D-核糖作为生物体内自然生成的还原性戊醛糖，其分子量小，结构不稳定，且广泛分布于细胞内外。近年来研究发现D-核糖具有很强的非酶糖基化能力，并已经在体内和体外的实验中证实核糖可与多种蛋白质，包括牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、清蛋白(albumin)、β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2M)、以及α-突触核蛋白(α-Synuclein)等发生快速的非酶糖基化反应，引起蛋白的聚集，形成AGEs，从而造成对细胞及机体的损伤[6,7,22-25]。而且，核糖糖基化速度显著快于葡萄糖，也更容易造成机体的损伤，因而对核糖糖基化的深入研究具有重要的生物学意义。

本研究通过将HMb分别与D-核糖/D-葡萄糖共孵育，采用紫外可见光谱观察Mb特征性吸收峰的变化，同时利用荧光光谱检测非酶糖基化反应产物AGEs的荧光衍生物形成情况。结果显示：D-核糖能在短期内可导致HMb的血红素活性中心构象发生变化，并产生AGEs的特征性荧光光谱改变。进一步通过SDS-PAGE电泳也证实D-核糖能很快地与HMb发生反应，形成多聚体。而在相同的反应条件下，D-葡萄糖对HMb构象的影响及AGEs的形成明显较D-核糖为弱。由此证实，D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地诱导HMb发生非酶糖基化，从而影响其结构，形成AGEs。这为进一步深入研究肌红蛋白的非酶糖基化，提供了一定的实验基础，同时为糖尿病及其并发症的防治提供了新的研究途径。

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D-riboseInducedRapidNon-enzymaticGlycationofHumanMyoglobin

YOU Yong,LIU Fang,GAO Shuqin,et al
(MedicalCollegeofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of D-ribose and D-glucose on molecular conformation of human myoglobin(HMb),determine the formation of advanced glycation end products (AGEs) through in vitro glycation,and provide new clues for the prevention and treatment of diabetes mellitus and its complications.MethodHMb was expressed in BL21(DE3),purified,and incubated with D-ribose or D-glucose.Structural changes of HMb were studied by using UV-Vis spectroscopy.The formation of AGEs was monitored by Fluorescence spectrum.The molecular weight changes of HMb after reaction were observed by SDS-PAGE.ResultsIt showed that the heme active site of HMb was altered by interactions with D-ribose in a time-dependent manner.Simultaneously,the specific fluorescence of AGEs was found to increase markedly with increasing the incubation time of HMb incubated with D-ribose.SDS-PAGE showed that HMb rapidly reacted with D-ribose and formed higher aggregates.However,D-glucose has slight effects on the structural change of HMb and the formation of AGEs under the same conditions.ConclusionIn summary,this study shows that D-ribose,but not D-glucose,rapidly induces ribosylation of human myoglobin and generates AGEs.

D-ribose; D-glucose; Myoglobin; non enzymatic glycation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.005

2016-03-26；

2016-05-31

湖南省教育厅资助科研项目(13C817)，湖南省卫生计生委科研计划课题项目(C2016041).

*通讯作者，E-mail:yoyomo916@163.com.

结论D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地诱导HMb发生非酶糖基化，形成AGEs。

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蒋湘莲)