丁苯酞在大鼠脑缺血—再灌注损伤中的神经保护机制的研究

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(1.南华大学附属第二医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2.广州市中山大学孙逸仙纪念医院南院急诊科)

·基础医学·

丁苯酞在大鼠脑缺血—再灌注损伤中的神经保护机制的研究

廖梓亘1*，陈慧2

(1.南华大学附属第二医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2.广州市中山大学孙逸仙纪念医院南院急诊科)

目的探讨丁苯酞注射液在大鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及可能的作用机制。方法

56只清洁级SD大鼠，随机平均分为假手术组,缺血—再灌注组,丁苯酞24 h治疗组,丁苯酞48 h治疗组。缺血2 h再灌注时，丁苯酞24 h治疗组及丁苯酞48 h治疗组分别予腹腔注射丁苯酞注射液每天20 mg/kg，直至各时间点处死。假手术组和缺血—再灌注组分别向腹腔注射等量生理盐水。观察各组脑缺血体积及脑源性神经营养因子(BDNF)阳性细胞数。结果丁苯酞治疗组比缺血再灌注组的脑缺血体积明显缩小，且丁苯酞48 h治疗组较24 h治疗组缩小更显著(P<0.05)。BDNF阳性细胞检测显示丁苯酞治疗组比缺血再灌注组的BDNF阳性细胞数明显增加，且丁苯酞48 h治疗组较24 h治疗组增多更明显，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论丁苯酞注射液可能通过诱导BDNF的表达从而发挥对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

丁苯酞； SD大鼠； 脑缺血； 再灌注损伤； 脑源性神经营养因

目前急性脑缺血性疾病是危害人类身体健康的重要疾病之一，使人的生命健康受到严重威胁。研究表明脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophical factor，BDNF)是一种由神经元产生的神经营养因子，广泛分布于中枢神经系统,尤其是大脑皮层[1],对神经元的存活、分化、生长和突触形成、突触连接及维持神经元正常的生理功能起着关键作用，同时对大脑损伤后脑功能的恢复起重要作用[2]。

丁苯酞是芹菜籽中提取物，为脂溶性药物,可通过血—脑屏障。既往研究表明丁苯酞可阻断缺血性脑损伤的一系列复杂的病理过程：可以抑制炎症细胞因子的释放，减轻脑水肿；改善脑缺血区的能量代谢；抑制神经细胞和血管内皮细胞的坏死和凋亡；从而缩小大鼠脑梗塞体积[3-6]。丁苯酞通过影响血管内皮细胞中一氧化氮合成酶(NOS)及NO水平[7]发挥抗血小板聚集和抗脑血栓作用[8-9]，但丁苯酞对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用机理尚未十分明确。本实验通过颈外动脉线栓法建立大脑脑缺血再灌注损伤模型，检测BDNF的表达情况，从而来探讨丁苯酞的神经保护作用机理，为其治疗脑缺血损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组清洁级健康雄性SD大鼠56只,体重200～250 g,由南华大学实验动物中心提供，许可证号：SYYK-025。随机将SD大鼠分为4组：假手术组,缺血—再灌注组,丁苯酞24 h治疗组，丁苯酞48 h治疗组,每组各14只。2 h后治疗组分别腹腔注射丁苯酞注射液20 mg/kg(石药集团恩必普药业有限公司)，一天一次，假手术组,缺血—再灌注组分别腹腔注射等量生理盐水。

1.2实验动物模型的制备参照Longa[10]线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，术前禁食、禁水后,麻醉，去毛发后，消毒，铺无菌孔巾；充分暴露左侧颈总动脉和迷走神经，轻柔分离左侧颈总动脉和迷走神经，结扎并离断左颈外动脉的分支，充分游离左侧颈外动脉，结扎翼腭动脉，用已准备好的鱼线，缓慢插入左侧颈内动脉，长度约为17±1.6 mm，结扎左侧颈外动脉穿刺部位，留有活结，逐层缝合组织及皮肤，将线外置；假手术组只暴露左侧颈总动脉而无其他处理。

1.3模型成功判断的标准神经行为学评估采用Bederson6级[11]5分评分标准进行。选择评分为1～4分的动物模型，但符合评分标准而有蛛网膜下腔出血及术后死亡者，随机补充。剔除评分为0分和5分的模型。

1.4脑缺血灶体积的测量各组SD大鼠脑缺血模型分别在缺血2 h后再灌注24 h、48 h，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g体重)腹腔注射麻醉后并处死，取脑组织，放入-20 ℃冰箱内冻存10 min后，逐层切成2 mm厚的脑片，置于2%TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，观察脑组织。正常脑组织呈红色，脑缺血组织呈白色。6 h后拍照并输入计算机，用BI-医学影像分析系统计算脑缺血灶面积，根据公式计算出脑缺血灶体积V=(C1+C2……Cn)/t-(C1+Cn)/2，(其中C为缺血灶面积，t为厚度，n为切片数)，以脑缺血灶体积/全脑体积作为统计参数。

1.5病理学检查大鼠断头后，取得的脑组织均用10%中性甲醛24 h固定，再予以酒精梯度脱水，石蜡包埋,取脑缺血顶叶部位脑组织连续切片，厚度为3 μm，分别做常规HE染色和BDNF免疫组化染色,BDNF染色参照SABC试剂盒说明书依照步骤进行，操作完成后在光学显微镜下观察拍片。

1.6 BDNF阳性细胞的形态观察与计数各组均取脑缺血顶叶部位，每组取9张大脑顶叶切片行BDNF免疫组织化学染色检测。显微镜下观察各切片BDNF阳性的神经细胞和分布情况及细胞形态学改变。显微镜目测器下对每张切片中BDNF阳性神经细胞计数,每个测定部位随机选5个视野,取BDNF阳性神经细胞平均数。

1.7统计学分析用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，实验结果数据用均数±标准差表示。组间两两比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1脑缺血灶体积和神经功能严重程度评分假手术组脑片染成均匀红色,未见脑梗缺血灶。缺血—再灌注组的脑组织有苍白脑缺血灶,可见皮质、皮质下白质和基底节区清晰的边界。丁苯酞24 h治疗组及48 h治疗组的脑组织染色后有范围不等的缺血灶,部位恒定，集中于大脑中动脉供血的额、顶叶皮质及基底节区。统计结果显示丁苯酞24 h治疗组及丁苯酞48 h治疗组的神经功能严重程度评分均较缺血—再灌注组显著改善，且丁苯酞48 h治疗组较丁苯酞24 h治疗组改善更加显著，差异均具有统计学意义。见表1。

2.2丁苯酞注射液对大鼠脑缺血再灌注的脑缺血灶体积及BDNF阳性细胞数丁苯酞24 h治疗组(t=19.753，P=0.000)、丁苯酞48 h治疗组(t=38.981，P=0.000)脑缺血灶体积较缺血—再灌注组显著缩小，而丁苯酞48 h治疗组较丁苯酞24 h治疗组改善更加显著(t=-19.751，P=0.000)；缺血—再灌注组、丁苯酞24 h治疗组、丁苯酞48 h治疗组、假手术组之间的BNDF阳性细胞数间差异存在显著性(表2)。丁苯酞24 h治疗组和丁苯酞48 h治疗组BNDF阳性细胞数显著高于缺血—再灌注组、假手术组(P均<0.05)，而丁苯酞48 h治疗组较丁苯酞24 h治疗组BNDF阳性细胞数增加显著(t=40.298，P=0.000)。

表1神经功能严重程度评分影响(分)

与缺血—再灌注组治疗后比较，a:P<0.05； 与丁苯酞24 h治疗组治疗后比较，b:P<0.05

表2脑缺血灶体积及BDNF阳性细胞数的影响

组别n脑缺血灶体积(mm3)BDNF阳性细胞数假手术组14—58.750±4.713缺血—再灌注组14101.678±11.75635.250±3.772a丁苯酞24h治疗组1482.998±5.876b85.875±2.031b丁苯酞48h治疗组1462.597±7.109bc93.750±4.713bc

与假手术组比较，a：P<0.05；与缺血—再灌注组比较，b：P<0.05；与丁苯酞24 h治疗组比较，c：P<0.05

2.3 HE染色显微镜下示假手术组神经细胞数量多，胞质深染，细胞核形态正常。缺血—再灌注组神经细胞稀疏，细胞间间隙增宽，大量细胞变性坏死，细胞间质呈空泡改变，水肿明显，胞体缩小，细胞核固缩。丁苯酞24 h治疗组神经细胞部分变性坏死，存活神经细胞较多，细胞形态欠正常，细胞间间隙增宽。丁苯酞48 h治疗组神经细胞数目明显增多，细胞间隙稍增宽，细胞形态学相对正常(图1)。

图1 大鼠脑缺血2 h后再灌注后脑组织的病理切片(HE染色400×) A：缺血—再灌注组；B：假手术组；C：丁苯酞24 h治疗组；D：丁苯酞48 h治疗组

2.4 BDNF免疫染色显微镜下可见，假手术组胞浆内几乎未见棕褐色或者黄色阳性细胞；缺血—再灌注组阳性细胞胞浆内可见少量的棕褐色或者黄色细胞，BDNF之间间距较大。丁苯酞24 h治疗组可见大量的阳性细胞胞浆呈棕褐色或者黄色，BDNF表达明显增多。丁苯酞48 h治疗组阳性细胞胞浆呈棕褐色或者黄色最多，较其他组BDNF表达明显增多，BDNF之间间距较小，密度高(图2)。

图2 大鼠脑缺血2 h后再灌注后BDNF阳性细胞数(免疫染色400×) A：缺血再灌注组；B：假手术组；C：丁苯酞24 h治疗组；D：丁苯酞48 h治疗组

3 讨 论

既往研究表明丁苯酞对神经损伤具有重要的保护作用。即使神经损伤超过24 h，应用丁苯酞仍可起到减轻脑细胞水肿的作用[12]；通过提高受损脑皮质内胆碱乙酰基转移酶的活性，起到修复神经功能，改善脑缺血后神经功能损伤[13]；减少中性粒细胞浸润以及炎症细胞因子的释放，缩小缺血脑组织的梗塞面积[14]； 改善大脑中动脉栓塞缺血区细胞的脑能量代谢和微循环血流量[15]；还可以抑制神经细胞和血管内皮细胞的坏死和凋亡[16]。然而目前丁苯酞对缺血再灌注损伤的神经保护作用具体机理还不明确，本文丁苯酞对缺血再灌注损伤神经保护作用的可能机制进行探讨。

本研究示缺血—再灌注组大鼠的Longa评分最高，大鼠肢体功能瘫痪明显，神经功能缺损最严重。丁苯酞腹腔注射组Longa评分显著减低，大鼠肢体功能瘫痪程度减轻，神经功能缺损得到显著改善，丁苯酞48 h治疗组改善更为明显。丁苯酞治疗组脑缺血灶体积明显小于缺血—再灌注组，且丁苯酞48 h治疗组脑缺血体积较24 h治疗组明显缩小，具有统计学差异，说明丁苯酞的保护作用有时间效应，随着治疗时间延长，受损的神经功能及脑缺血体积改善更加明显。本研究中丁苯酞改善神经缺血性损害的作用，与相关研究结果一致[17]。

另外光学显微镜下见，假手术组神经细胞数量多，胞质深染，细胞核形态正常；缺血—再灌注组神经细胞稀疏，细胞间间隙明显增宽，大量细胞变性坏死，细胞间质呈空泡改变，水肿明显，胞体缩小，细胞核固缩；丁苯酞24 h治疗组神经细胞部分变性坏死，存活的神经细胞较多，细胞形态欠正常，细胞间间隙增宽；丁苯酞48 h治疗组神经细胞数目明显增多，细胞间隙稍增宽，细胞形态学相对正常。与既往实验结果一样[18]，说明丁苯酞具有促进神经细胞恢复的作用。

本文还发现丁苯酞组BDNF阳性细胞数较假手术组及缺血—再灌注组明显增多(P<0.05)，进一步比较中发现48 h组较24 h组的阳性细胞数明显增多，BDNF之间距离缩小，分布密度增高(P<0.05)，丁苯酞有诱导BDNF的表达，提示BDNF参与脑缺血再灌注损伤的神经保护过程，从而得出丁苯酞可能通过诱导BDNF的表达来发挥对脑缺血再灌注的神经保护作用。

综上所述，本文发现丁苯酞注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤可以缩小脑缺血体积，改善缺血半暗带区的细胞学形态，增加残存神经细胞数量，发挥神经保护作用。通过进一步对BDNF的检测，提示丁苯酞可能通过诱导BDNF的表达来发挥对脑缺血再灌注的神经保护作用。但本文未对大鼠脑缺血再灌注损伤后不同剂量、超早期的丁苯酞未进行研究，因此存在一定局限。

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ButylphthalideinMiceIschemia-reperfusionInjuryofNerveProtectionMechanismResearch

LIAO Zigen,CHEN Hui

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the neuroprotection of Butylphthalide in mice after ischemia-reperfusion injury and its mechanism.Methods56 clean-healthy SD rats were randomly divided into four groups:sham group，ischemic-reperfusion group,NBP for 24 hours group,NBP for 48 hours group.At the time of reperfusion after ischemia 2 h,the two NBP groups were treated with NBP (20 mg/kg,QD) by intraperitoneal injection until they were executed,also the sham group and the ischemic-reperfusion group were treated with the same dose of normal saline by intraperitoneal injection.ResultsThe volume of cerebral ischemia in NBP-group was smaller than the ischemic-reperfusion group,what was more,the NBP-48 group was much more smaller than NBP-24 group,all had statistical significance(P<0.05).The number of BDNF-positive cell in NBP-group was much more than the ischemic-reperfusion group,and NBP 48-group increased more obviously than NBP- 24 group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionButyl phthalide injection can induce the expression of BDNF and have protective effect on rats nerve with ischemia-reperfusion injury.

Butylphthalide； SPrague-Dawley rats； brain ischemia； reperfusion injury； brain derived neurotrophic factor

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.009

2015-12-15；

2016-03-28

*通讯作者，E-mail:lzg18773472527@163.com.

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