rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用

朱洪庆，王盼盼，张 萌，陈嘉慧，丁 祥

(西华师范大学 a.生命科学学院；b.西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009)



rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用

朱洪庆，王盼盼，张 萌，陈嘉慧，丁 祥

(西华师范大学 a.生命科学学院；b.西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009)

采集了四川马尔康地区3种真菌，根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱，初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种。为提高鉴定的准确性，通过构建基因池；用特异性引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序；将测得的实验样品的序列在GeneBank中进行BLAST比对；并与相似性较高的已知的种，利用DNAMAN、Clustalx1.83和MEGA5.0软件采用N-J法构建进化树，探寻他们与已知物种的相关关系。结果表明，三种疑似菌株扩增出的目的条带为500—750bp，J1、J2、J3号菌株分别与臭黄菇、松乳菇、红菇的序列相似度最高。 并利用序列的相似性做出了它们各自的进化树。最终得出结论：J1号菌株为臭黄菇(Russulafoetens)，J2号菌株为松乳菇(Lactariusdeliciosus)，J3号菌株为红菇(Russula.)。利用rDNA-ITS序列分析法和形态学分类法相结合的方法鉴定菌种，不仅丰富了三种真菌的基因库，而且也克服了单纯的rDNA-ITS序列分析法因受基因库的完善程度、高度相似性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等限制而不能鉴定出所有真菌的缺点，提高了真菌分类鉴定中一些模糊性状的区分度。

真菌；鉴定；rDNA；ITS；PCR；测序

传统的真菌鉴定方法主要通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验来鉴定。全世界的大型真菌种类繁多，如果只利用真菌的形态学、生理生化特点等特征来鉴定真菌，不仅需要丰富的真菌鉴定工作经验而且需要花费较长的时间，而且对于某些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定，常会得出假阳性或假阴性结果，使鉴别显得非常困难[1,2]。随着核酸分子生物学技术的发展，特别是发现DNA的双螺旋结构以来，分子生物学得到迅速发展，并且已应用到各个学科领域。

真菌基因组中有4种编码核糖体RNA(rDNA)基因，包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA[3]。而真菌rDNA的18s和28s之间的片段含有真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)[3,4]，主要包括18S rDNA、内转录间隔区1(ITS1)、5.8 S rDNA、内转录间隔区2(ITS2)和28 S rDNA，这些序列保守性强，又含有可变区和高变区，它们头尾串联成一个重复单位，其长度一般为650—750bp，其结构如图1所示[2]。而ITS4和ITS5两对引物通常可以用来作为大多数的担子菌和子囊菌的特异性鉴定引物[5-7]。rDNA上的5.8S、18S和28S rDNA存在着广泛的异种相似性，在进化过程中ITS序列所承受的自然选择压力一般较小，因此可能会有更多的变异，也具有更多的可遗传性状，成为ITS序列在真菌种类鉴定及其进化分析的理论基础[8-10]。对编码rDNA的序列分析可用于未知真菌的鉴定或者对表型鉴定结果进行验证。利用PCR 扩增真菌核糖体ITS(Internal Transcribed Spacer)基因区段进行真菌鉴定的方法因其快速、简便而得到迅速地发展[11]。然而，仅根据对编码rDNA的序列分析来鉴定未知真菌，由于相似序列的数量繁多，不同种间相似序列的差异很小，有些可达99%的相似度，对鉴种的工作增加了难度，如果加之传统的分类学方法，可以更好的确定其种属。

我们在四川马尔康地区采集了3种菌株，根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱，初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种。采用rDNA-ITS序列分析法从分子生物学角度验证宏观种属鉴定的准确性，并为提高真菌鉴定中一些模糊性状的区分度，实现真菌种属的准确鉴定提供理论依据和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

真菌样品于2015年7—8月在四川马尔康地区采集，采集过程中记录其生境、习性，并保证其菌株的完整性(包括菌盖、菌环、菌托及地下部分)，拍照记录，然后将其干燥后带回实验室，储存于干燥的地方。

CTAB抽提液[4][Tris-HCl(pH=8.0, 1 mol/L)、CTAB(分析纯)、EDTA(pH=8.0, 0.5mol/L)、1.4mol/L NaCl(分析纯)]，10 × Taq Reaction Buffer(Mg2+free)，β-巯基乙醇，CIA，dNTP(2.5mM each)，MgCl2(25mM)，Taq DNA Polymerase(2.5U/μL)，异丙醇，70%乙醇，琼脂糖，50×TAE电泳缓冲液，D2000 Marker，EB染色液，凝胶回收试剂盒。

1.2 仪器与设备

使用仪器笔设备有恒温震荡箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、微量移液器。

1.3 传统分类法鉴定真菌

根据记录的三株菌株的生境和形态学特征，结合卯晓岚[14]主编的《中国大型真菌》图谱，初步鉴定出J1、J2、J3的科属。

1.4 实验方法与步骤

1.4.1 总DNA提取

选取三种真菌样品的子实体各6株，每个子实体均将干燥的菌盖样品剪碎，然后每种真菌称取等量的混合样品放入研钵，用液氮将其研磨充分，将研磨完的粉末状样品转入已写好编号的EP管，并按照CTAB法提取DNA[11]，提取的DNA产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，放在-20℃冰箱保存以待扩增。

1.4.2 PCR扩增ITS序列

PCR扩增引物[4]：ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC3’- ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’- (均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)

PCR扩增体系(50μL): MagicMix 2.0(25μL)，DNA模板(2μL)，ITS4 (1μL)，ITS5(1μL)，ddH2O(21μL)。

PCR扩增程序：预变性 (94℃ 5min)，变性(94℃ 30s)，复性(52℃ 30s)，延伸(72℃ 1min)，40个循环，72℃延伸5min。

1.4.3 PCR结果检测

取扩增反应产物7.0μL并与6×Loading Buffer混匀，在含有10 mg/mL EB的2 %的琼脂糖凝胶上进行点样，于1.0 × TAE缓冲液(电压为80V)中电泳。当溴酚蓝离点样孔大约距离整个胶的2/3处时，停止电泳，将取出的凝胶放在凝胶成像系统中，观察并拍照。[4]

1.4.4 ITS片段纯化、测序

根据PCR电泳的结果，将500 —700bp左右的一条目的条带经试剂盒(Universal DNA Purification Kit)进行纯化，将含有非特异性条带的PCR产物经电泳、切胶、收集目的条带，并用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，并将纯化后的PCR产物送去英俊测序公司进行上下游引物双向测序，得到测序结果[11-13]。

1.5 进化树的构建

将测序结果利用BankIt工具上传至GeneBank，获得登录号，选择其中最短的扩增序列，以此长度为基本比对长度，在NCBI数据库寻找登记序列中含有与该三种序列相似度高的片段，通过BLAST工具和DNAMAN软件对序列进行分析，截去两侧扩增差异较大的碱基对，使比对的序列大小几乎一致，重新用Clustalx 1.83软件进行完全比对，利用MEGA5.0软件采用邻位相连法(N-J，neighbor-joining)构建系统进化树[15，16]。

1.6 传统分类法与现代分类法相结合

根据构建的进化树，然后结合记录的形态学特征，共同确定出这三株菌株的具体种属。

2 结果与分析

2.1 传统分类法的最初鉴定结果

根据《中国大型真菌》记录的三株菌株的生境形态特征、菌盖、菌环、菌褶、菌柄等的颜色形态特征初步确定它们均为担子菌亚门层菌纲伞菌目红菇科的菌株[14]。结果如图2所示。臭黄菇的形态特征为：子实体中等大，菌盖土黄至浅黄褐色，表面粘滑，边缘有小疣组成的明显的粗条棱；菌盖扁半球形，菌肉污白色，具腥臭味，菌褶白色至浅黄色，有深色斑痕，菌柄较粗壮，圆柱形，污白色至淡黄色，内部松软至空心。松乳菇的形态特征为：子实体较大，菌盖扁半球形，中央脐状，伸展后下凹，虾仁色或深橙色，有较明显的环带；菌肉初期带白色，菌褶与菌盖同色，直生，褶间有横脉，菌柄较粗壮，圆柱形。红菇的形态特征为：子实体中等大，菌盖扁半球形，后平展至中下凹，红色，不粘，边缘无条纹，常有分叉；菌肉菌褶白色，褶间具横脉。根据以上结果，我们初步鉴定实验样品J1和J3为红菇属，J2为乳菇属，其中，J1、J2、J3分别是臭黄菇、松乳菇和红菇。

2.2 PCR扩增结果

提取J1、J2、J3号真菌菌株DNA，进行PCR扩增，其rDNA—ITS PCR扩增产物进行凝胶电泳后均能扩增出目的条带(图3)，扩增产物大小均在500—750 bp之间。

2.3 rDNA-ITS序列测序与比对结果

3种真菌的扩增测序结果上传至GeneBank，获得其登录号，登录号情况如下：J1实验样品，登录号为KX034409，687bp；J2实验样品，登录号为KX034408，718bp；J3实验样品，登录号为KX034407，644bp。

将我们实验样品获得的序列与从GeneBank获取的相似较高序列经DNAMAN和Clustalx1.83软件进行比对分析并用MEGA 5.0构建N—J系统发育树(图4—6)。根据系统发育树并结合各比对指标来确定距离与相似性均具有较大鉴定意义的比对序列[16-17]。J1(KX034409)与臭黄菇(Russulafoetens)中KF245487高达99%的相似度；J2(KX034408)与松乳菇(Lactariusdeliciosus)的DQ116896序列有100%的相似度；J3(KX034407)与红菇(Russula.)中GU083106可达99%的序列相似性。

2.4 rDNA—ITS序列分析法与传统分类法相结合，最终鉴定结果

根据图4—6可知，J1、J2、J3的rDNA—ITS序列分别与臭黄菇(Russulafoetens)、松乳菇(Lactariusdeliciosus)、红菇(Russula.)有很高的相似性，进一步证实了传统分类法中的最初鉴定结果。

最终，我们根据《中国大型真菌》记录的三株菌株的形态特征，包括生境情况、菌盖、菌环、菌褶、菌柄等颜色形态特征，结合rDNA-ITS序列分析法，确定J1(KX034409)为臭黄菇(Russulafoetens)，J2(KX034408)为松乳菇(Lactariusdeliciosus)，J3(KX034407)为红菇(Russula.)。

3 讨 论

根据传统分类法和分子生物学方法相结合的方法，对在四川马尔康地区采到的三种菌株进行鉴定，先根据三种菌株的形态特征，可初步鉴定为红菇科的某些种类，然后再依照《中国大型真菌》，断定它们可能是臭黄菇、松乳菇和红菇这三种。但由于某些特征有些模糊，并不能直接断定到这3个种。利用这3个种的rDNA-ITS序列分析法，做出它们各自的系统进化树研究，最终能确定这三种菌株分别是臭黄菇(Russulafoetens)，松乳菇(Lactariusdeliciosus)和红菇(Russula.)。这种传统分类法和现代分子技术相结合的方法，是菌种鉴定的一种十分重要的方法。

采用分子生物学手段鉴定真菌，最关键的是能否从待测样品中得到稳定、量高、质佳的真菌DNA模板。研磨是否充分对DNA的提取至关重要，当研磨不充分时，提取的DNA量很少，而且PCR扩增出来的产物经检测的条带很少或者不亮。PCR完成后应检测扩增效果，常用电泳的方法进行目的序列的检测，如图3所示，当在500—750bp位置出现单一并且较亮的条带时表明扩增出目的条带，若无任何条带或条带并未在500—750bp位置表明DNA提取或者扩增无效，若在此位置出现的条带多而亮表明DNA不纯[1]。

在进行序列比对分析时，从核酸序列数据库中BLAST出来的相似序列较多，选择的相似序列应该在500—800bp，虽然较多的相似序列可以为系统学研究提供更大的参考意义和更多的信息，但另一方面过多的相似序列也会使菌种鉴定工作更加复杂困难。而且随着GeneBank的不断丰富，不同种间的ITS序列差异越来越小，单靠分子生物学方法无法鉴定菌种的种属，此时就应当结合传统分类学的方法，根据它们形态学的特征，更准确的鉴定真菌，同时还可以使用其它的序列比对分析工具，比如DNAMAN软件。这种现代分子生物学方法与传统分类法相结合的鉴定菌种方法是一种更广泛的鉴定法，具有更大的生物学意义。

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Application of rDNA-ITS Sequence Analysis and Traditional Classification Method in the Identification of Fungi

ZHU Hongqing,WANG Panpan,ZHANG Meng,CHEN Jiahui,DING Xiang

(a.College of Life Sciences;b.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China)

In this paper,the ITS sequence diversity analysis of the large fungal fruiting body,combined with the traditional morphological identification method,was applied to the identification of large fungi.We collected three kinds of fungi in Sichuan Barkam region and initially identified that they were the suspectedRussulafoetens,LactariusdeliciosusandRussulaspecies,according to its morphological characteristics with the “China macro-fungi” map written by Mao Xiaolan.To improve the identification accuracy,we constructed gene pool;PCR was amplified by specific primers,and the amplified products were sequenced.The sequence of the measured samples was compared by using BLAST in GeneBank,and found the known species with high homology,and the N-J method was used to construct the phylogenetic tree with DNAMAN,Clustalx1.83 and MEGA5.0 software to explore their correlation with the known species.The results showed that amplified purpose bands of three suspected strains were 500—750bp,J1,J2 and J3 strains’ sequence respectively had a high similarity withRussulafoetens,LactariusdeliciosusandRussula,and made their respective phylogenetic tree by the use of sequence similarity.Finally, the conclusion was that the strain J1 wasRussulafoetens,the J2 strain wasLactariusdeliciosus,and the J3 strain wasRussula.The method of species identification which combined the rDNA-ITS sequence analysis with morphological classification,not only enriched the gene pool of three fungal species,but also overcame the shortcomings of the only one rDNA-ITS sequence analysis method that could not identify out all fungi because of the limit,like the improvement degree of gene pool,number of highly homologous sequences and specific species of rDNA-ITS region of variable degree and improved the division of some fuzzy traits in fungi.So the method of identifying strains combined the traditional classification method with the analysis of rDNA-ITS sequence had been widely applied in the identification of large fungi.

fungi;identification;rDNA;ITS;PCR;sequencing

1673-5072(2016)03-0264-06

2016-04-06 基金项目：国家自然科学基金项目(31200012)；四川省科技厅基础应用项目(2014SZ0020 )，四川省教育厅重大培育项目(16CZ0018)

朱洪庆(1990—)，女，四川达州人，硕士研究生，主要从事真菌多糖免疫活性研究。

丁 祥(1980—)，男，安徽宿州人，博士，教授，主要从事细胞学和分子生物学研究。E-mail:biostart8083@126.com

Q939.5

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.03.006