对亚硝酸盐含量检测的确定与方法验证

■文/马晓君

对亚硝酸盐含量检测的确定与方法验证

■文/马晓君

亚硝酸盐广泛存在于土壤、水、蔬菜及腌制的动物性食品中,也是广泛存在于自然环境中的化学物质。自然界中的很多食物，包括粮食、蔬菜、鱼类、蛋类、肉类中都含有亚硝酸盐。蔬菜是人们日常生活中摄入量最多的，也是一种易于富集硝酸盐的植物性作物。

据国际粮农组织1990年统计，人体所需的90%维生素C、60%维生素A均来自蔬菜，蔬菜提供人体所需维生素的同时，也提供了进入人体80%～90%的硝酸盐。现代医学证明，虽然硝酸盐对人体没有直接毒害作用，但过量的硝酸盐进入人体后，在一些酶和微生物作用下可转变为有毒的亚硝酸盐。亚硝酸盐是强氧化剂，进入血液与血红蛋白结合，使氧合血红蛋白变为高铁血红蛋白，从而失去携氧能力,导致组织缺氧，而出现一系列缺氧的中毒病症，严重时可使人死亡。另外，亚硝酸盐对血管有扩张作用，它还可与胃中的次级胺结合形成致癌物质亚硝酸胺，引起消化系统癌变；亚硝酸盐也可以通过胎盘进入胎儿体内，引起胎儿畸变。因此,硝酸盐和亚硝酸盐含量是评价蔬菜品质的重要指标之一。

选择以黄瓜为例的瓜类、以白菜为例的绿叶类、以茄子为例的茄果类蔬菜作为试材。

亚硝酸盐含量测定

一、溶液配制（G B5009.33-2010）

1、饱和硼砂溶液（50g/L）：称取5.0g硼酸钠(Na2B07・10H2O)，溶于100mL热水中，冷却后备用。

2、亚铁氰化钾溶液（106g/ L）：称取1 0 6.0 g亚铁氰化钾[K4Fe9(CN)5・3H2O]，用水溶解，并稀释至1000mL。

3、乙酸锌溶液（220g/L）：称220g乙酸锌[Zn(CH2C00)2・2H2O]，先加30mL冰乙酸溶解，用水稀释至1000mL。

4、对氨基苯磺酸溶液（4g/ L）：称0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%（V/V）盐酸中，混匀后，至棕色瓶中，避光保存。

5、N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐溶液(2g/L):称取0.2gN-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐，溶入少量水中后全部转移至100mL容量瓶中，加水至标线，混匀。置于棕色瓶避光保存。

6、亚硝酸钠标准溶液（100g/ L）:准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水移入1000mL容量瓶，加水稀释至刻度，混匀。

7、亚硝酸钠标准溶液（10g/ L）：临用前，吸取10mL亚硝酸盐标准溶液，置于100mL容量瓶，加水稀释至刻度。

所用试剂未注明均为分析纯，实验用水均为去离子水。所有实验用的玻璃仪器均用去离子水冼涤使其彻底干净，以确保无外来硝酸根离子(NO3

-)和亚硝酸根离子(NO2-)的干扰。

二、标准曲线

采用国家标准（GB5009.33-2010）盐酸萘乙二胺法。配制一系列各浓度的亚硝酸盐溶液：取10ug/ mL亚硝酸钠标准使用液0.00mL、0.10m L、0.20m L、0.40m L、0.60m L、0.80m L、1.60m L、2.00mL，分别置于50mL带塞比色管中。于标准管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，放置3-5min，加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色皿，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制亚硝酸盐的标准曲线。

根据标准曲线，采用下式计算亚硝酸盐含量，亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）：

X1——样品中亚硝酸盐的含量（mg/kg）；

M——样品质量（g）；

A1——测定用样液中亚硝酸盐的质量（μg）；

V0——样品处理液总体积（mL）；

V1——测定取样液体积（mL）。

三、回收率的测定

参考马巍（1999）[8]方法，采用加外标回收率的方式验证样品消解损失程度和方法的准确度。

四、精密度测定

配制10ug/mL亚硝酸盐标准溶液，移取0.8mL的该标准溶液于50mL比色管内，按照重氮化偶合法在538nm处重复测定标样7次，计算吸光度的平均值和标准平均偏差。

五、数据处理

对试验试数据采用Excel及SPSS 13.0统计软件处理。

结果与分析

一、标准曲线制作

图1 亚硝酸盐标准曲线

由标准曲线（见图1）可知，标准工作曲线线性良好，不同浓度的亚硝酸盐在538nm处的吸光度是呈线性规律，其回归方程为y=0.6489x+0.0023，线性相关系数R=0.9997，相对系数在0.9995以上。

二、样品前处理条件确定

1、提取温度和水浴时间对亚硝酸盐检测结果的影响

不同提取温度和水浴时间对亚硝酸盐的影响检测结果见图2。

图2 不同提取温度和水浴时间对亚硝酸盐的影响

由图2可以看出，不同温度下溶液对亚硝酸盐的溶解量及提取速度存在差异，100℃时，水浴时间45min提取的亚硝酸盐含量最高；70℃时，水浴时间45min提取的亚硝酸盐含量最高，但两种温度相比70℃水浴下提取的亚硝酸盐含量更为高，因此提取亚硝酸盐的最佳水浴条件是70℃的水浴45min。

2、不同显色时间对亚硝酸盐检测结果的影响

不同显色时间对亚硝酸盐检测结果的影响测定结果（见图3）显色15min时，亚硝酸盐含量检出率最高，之后随着显色时间的延长，亚硝酸盐的吸光度变小，35min后虽稍有上升，但幅度不大。亚硝酸盐和显色剂反应可生成络合物，显色15min时，其吸光度最大。故宜选择15min作为显色时间。

3、活性炭对亚硝酸盐测定结果的影响

图3 不同显色时间对亚硝酸盐含量测定结果的影响

活性炭对亚硝酸盐含量的测定结果（见图4）可以看出，加入活性血酸对亚硝酸盐测定的干扰，使得亚硝酸盐检出值更为准确。因此，宜炭的试验组样品中亚硝酸盐检出值为3.50mg/kg，无活性炭的试验组样品亚硝酸盐检出值为1.00mg/kg，二者差异极显著。活性炭可消除抗坏选择加入活性炭处理，以提高检出率。

图4 活性炭对检测结果的影响

三、方法验证

样品亚硝酸盐回收率试验测定结果（见表1）表明，3个样品的亚硝酸盐回收率分别为91.11%、91.00%、102.00%，平均回收率为94.63%，相对平均偏差为5.1%。检出限数值越低，仪器和方法的灵敏度越高；内标回收率越高，仪器的准确度和精密度越高；外标回收率越高，消解损失程度越低，方法准确度越高。在运用分光光度法对样品进行测定时，通常需要测出所用方法的待测元素的回收率，以此评价方法的准确度和可靠性，回收率越接近1，则方法的可靠性越高。

由精密度试验测定结果（见表2）可见，通过重复测定标样七次和计算吸光度的重复性，亚硝酸盐的相对标准偏差为0.29%，小于2%，表明完全可满足试验精密度要求。

采用国标（G B 5 0 0 9.3 3-2010）盐酸萘乙二胺法测定蔬菜中亚硝酸盐，样品前处理的最佳条件是在70℃水浴45min，显色15min，加入活性炭进行消除抗坏血酸处理，平均回收率可达到94.63%，亚硝酸盐的相对标准偏差为0.29%，相对平均偏差为5.1%。

（作者单位：甘肃省产品质量监督检验中心）

表1 回收率试验测定结果

表2 精密度试验测定结果