有机灵芝破壁孢子粉增强免疫力功能的实验研究

金龙哲，车成来，王霞，王宇辉，王欣宇，林花

(延边州农业科学院，吉林延吉133001)



有机灵芝破壁孢子粉增强免疫力功能的实验研究

金龙哲，车成来，王霞，王宇辉，王欣宇，林花＊

(延边州农业科学院，吉林延吉133001)

选用小鼠为实验对象，随机分成实验组和对照组。实验组分别按3.33g、6.67g、20.00g加蒸馏水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw体积给小鼠灌胃，每天1次，连续灌胃至少30d。对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。进行迟发型变态反应、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、抗体生成细胞检测、半数溶血值(HC50)的测定、小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、NK细胞活性的测定实验。结果表明：经口灌胃给予小鼠不同剂量的灵芝破壁孢子粉30d，能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、NK细胞活性、抗体生成细胞数、半数溶血值。灵芝破壁孢子粉具有增强小鼠免疫力作用。

有机灵芝；破壁孢子粉；免疫调节；小鼠

灵芝孢子粉(Ganodermaspore)，是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌盖弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。每个灵芝孢子只有4～6μm，是活体生物体，双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收。破壁后更适合人体肠胃直接吸收，它是灵芝的精华部分，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用[1]。它具有增强机体免疫力[2]、抑制肿瘤[3]、 降血糖[4]、降血脂[5]、护肝[6]、 抗病毒[7]、抗辐射等多种药理作用。 长白山有机灵芝是在长白山区独特的冷凉气候条件下按国际有机灵芝栽培规范栽培的有机灵芝[G.lucidum(Leyss ex Fr.)Krast]，本研究利用长白山有机灵芝破壁孢子粉对实验小鼠进行了免疫调节功能试验，为其功能性食品的开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 样品：由延边州农业科学院农特产品加工研究所提供，人口服推荐剂量为每日4g，成人体重按60kg计算，折合剂量0.0667g/kg·bw。

1.2 实验动物与分组：湖南斯莱克景达实验动物有限公司(实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2011-0003)提供的SPF级ICR种雌性小鼠200只，体重18～22g。每40只小鼠为1大组，共5大组。免疫Ⅰ组，进行碳廓清实验；免疫Ⅱ组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞的活性测定；免疫Ⅲ组，进行脏体比值测定、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞数的测定；免疫Ⅳ组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅴ组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。每大组40只小鼠按体重随机分为4小组，即对照组和低、中、高剂量组。

1.3 实验条件：为屏障环境，实验期间环境温度23～24℃，湿度54%～58%，实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2010-0011。

1.4 剂量选择及样品处理：据人体口服推荐量，设有机灵芝破壁孢子粉低、中、高剂量分别为0.333、0.667、2.000g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5倍、10倍、30倍)。试验时，分别取有机灵芝破壁孢子粉3.33、6.67、20.00g加蒸馏水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw体积给小鼠灌胃，每天1次，连续灌胃至少30d。对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。

1.5 主要仪器与试剂

动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜等。

无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。

SRBC、生理盐水、Hank’s液、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA、1%冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇、MTT、PBS缓冲液(pH7.2～7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氧化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.6 实验方法

1.6.1 脏器/体重比值测定。称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。

1.6.2 迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)。小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC(0.2mL/每鼠)致敏后4天，测量左右足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC(20μL/每鼠),于注射后24h测量左右足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度[3]。

1.6.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)。无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一个孔作为对照，置5%二氧化碳培养箱，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴的增值能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示[8]。

1.6.4 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)，将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8 mLHank’s液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ mL。将表层培养基加热溶解后与等量的pH7.4/2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加入用SA液配制的10%SRBC 50μL(v/v)、20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(1∶8)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。

1.6.5 半数溶血值(HC50)的测定。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%(v/v，用生理盐水配制)SRBC 0.2mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取1mL置试管内，依次加入10%(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1∶8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10%(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：半数溶血值(HC50)=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数

1.6.6 小鼠碳廓清实验。小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1%Na2CO3溶液作空白对照，用722型分光光度计在600nm波长处比色测光密度值。将小鼠处死，取肝、脾，称重，计算吞噬指数a。

1.6.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)。小鼠腹腔注射20%(v/v，用生理盐水配制)的鸡红细胞(2000rpm,10min)悬液1mL，间隔30min,颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇∶丙酮(1∶1)固定，4%(v/v) Giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算巨噬率和吞噬指数：吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

1.6.8 NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000转/min)，弃上清液将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm离心10min，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(活细胞数应在95%以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL此为效应细胞，取传代后24h生长良好的YAC-1细胞用PRMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL 此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各100μL；上述各项均设3个平行孔，于37℃,5%二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温反应3～10min，每孔加入1mol/L的HCI30μL，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)。

NK细胞活性=〔(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)〕×100%

1.7 实验数据统计

用Eecel、Spss软件进行数据转化和统计分析。用Spss13.0软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与1个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane’s T2检验进行两两比较。

2 结果

2.1 样品对小鼠体重的影响

见表1～5，各剂量组实验初期、实验中期、实验末小鼠体重及试验期间小鼠体重增长与对照组比较，差异均无显著性(P﹥0.05)。

表1 免疫Ⅰ组小鼠体重

表2 免疫Ⅱ组小鼠体重

表3 免疫Ⅲ组小鼠体重

表4 免疫Ⅳ组小鼠体重

表5 免疫Ⅴ组小鼠体重

2.2 样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响

见表6。样品各剂量对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无显著影响(P﹥0.05)。

表6 样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响

2.3 样品对小鼠细胞免疫功能的影响

2.3.1 样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响。见表7。中、高剂量组小鼠迟发型变态反应能力与对照组比较显著提高(P﹥0.05)。

表7 样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

2.3.2 样品对小鼠ConA诱导的淋巴细胞转化能力的影响。见表8。样品各剂量对小鼠淋巴细胞转化能力无显著影响(P﹥0.05)。

表8 样品对小鼠淋巴细胞转化能力的影响

2.4 样品对小鼠体液免疫的影响

2.4.1 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响。见表9。中、高剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组比较显著提高(P﹥0.05)。

表9 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响

2.4.2 样品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响。见表10。高剂量组小鼠半数溶血值(HC50)与对照组比较显著提高(P﹥0.05)。

表10 样品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响

2.5 样品对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

2.5.1 样品对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响。见表11。各剂量组对小鼠碳廓清能力的影响(P﹥0.05)。

表11 样品对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响

2.5.2 样品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响。见表12-1、12-2。样品各剂量对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无显著影响(P﹥0.05)。

表12-1 样品对小鼠巨噬细胞吞噬 鸡红细胞吞噬率的影响

表12-2 样品对小鼠巨噬细胞吞噬 鸡红细胞吞噬指数的影响

2.6 样品对小鼠NK细胞活性的影响

见表13。中、高剂量组对小鼠NK细胞活性与对照组比较显著提高(P﹤0.05)。

表13 样品对小鼠NK细胞活性的影响

3 结论

在本实验室条件下，经口灌胃给予小鼠0.333、0.667、2.000g/kg·bw剂量的有机灵芝破壁孢子粉30天，与对照组比较，0.667、2.000g/kg·bw剂量能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、NK细胞活性、抗体生成细胞数，2.000g/kg·bw剂量能显著提高小鼠半数溶血值(P﹤0.05)，各剂量对小鼠体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、单核-巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无显著影响(P﹥0.05)。本研究通过测定小鼠迟发型变态反应、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、抗体生成细胞检测、半数溶血值(HC50)的测定、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、NK细胞活性等指标，分析长白山有机灵芝破壁孢子粉对实验小鼠的免疫功能作用。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003)判定，有机灵芝破壁孢子粉对小鼠具有提高免疫力功能。

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2016-08-24

金龙哲(1965-),男,副研究员,主要从事天然产物提取和功效成分研究；*通讯作者：林花，助理研究员， E-mail：23124951@qq.com。

S567.3+1

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DOI.:11.13268/j.cnki.fbsic.2016.06.005