单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法学研究

陈愉生，陈小燕，陈正伟，黄文森，李鸿茹，许能銮



·方法学研究·

单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法学研究

陈愉生，陈小燕，陈正伟，黄文森，李鸿茹，许能銮

目的 探讨单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型的方法，为COPD动物模型的建立提供参考。方法 将24只Wistar大鼠随机分为对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组、烟雾暴露12组，每组6只。将烟雾暴露组大鼠置于自制玻璃染毒箱中，烟雾暴露2 h/d，5 d/周；对照组大鼠同时放在另一自制玻璃染毒箱中，自由呼吸空气。观察各组大鼠一般情况，比较各组大鼠肺功能指标、支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数及肺组织病理学检查结果。结果 (1)一般情况：对照组大鼠整个实验过程中活动正常，毛发白亮细密，精神佳，无气促、发绀，食量好；烟雾暴露8周组大鼠活动减少，倦卧，毛发黄涩无光泽；烟雾暴露10周组大鼠活动进一步减少，精神不佳，毛发黄涩，食欲下降，间歇咳嗽偶有喘息；烟雾暴露12周组大鼠活动较烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组大鼠减少，精神萎靡，毛发枯糙发黄脱落，口唇及指抓发绀，消瘦。(2)肺功能指标：烟雾烟雾暴露12周组大鼠0.3秒用力呼气容积与用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)和肺动态顺应性(Cdyn)低于对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组，吸气阻力(Ri)和呼气阻力(Re)高于对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组(P<0.05)；烟雾暴露8周组和烟雾暴露10周组大鼠Cdyn低于对照组(P<0.05)。(3)支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数结果：烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组、烟雾暴露12周组大鼠炎性细胞计数和中性粒细胞分数高于对照组，巨噬细胞分数低于对照组(P<0.05)；但4组大鼠淋巴细胞分数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(4)肺组织病理学检查结果显示，对照组大鼠支气管和肺泡结构清晰，气道黏膜上皮细胞排列整齐，肺泡大小均匀；烟雾暴露8周组大鼠肺组织以炎性细胞浸润为主；烟雾暴露10周组大鼠肺组织炎性细胞浸润更明显，气管壁平滑肌、纤维结缔组织增生，可见少许肺泡壁破坏；烟雾暴露12周组大鼠气道上皮脱落，气道内黏液和细胞阻塞，肺组织结构破坏明显，肺泡扩张，肺泡间隔断裂，相邻肺泡融合形成肺大泡，小血管壁增厚。结论 在自制玻璃染毒箱中单纯烟雾暴露12周可成功建立COPD大鼠模型。

肺疾病，慢性阻塞性；烟雾；大鼠；模型，动物；方法学研究

陈愉生，陈小燕，陈正伟，等.单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法学研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24(10)：58-62.[www.syxnf.net]

CHEN Y S，CHEN X Y，CHEN Z W，et al.Methodological study for modelling rat model of COPD caused by simple smog exposure[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(10)：58-62.

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种病因复杂的慢性常见病、多发病，可严重危害人类健康，且其确切发病机制尚未完全明确。目前，临床上关于COPD的治疗仍局限于对症治疗，而建立理想COPD动物模型对预防和治疗COPD具有重要意义。国内外学者目前比较认可采用单纯烟雾暴露方法建立COPD动物模型，但该建模方法与其他建模方法相比尚不成熟。尽管目前临床研究者对单纯烟雾暴露建立COPD模型进行了较多研究，但方法学尚未统一，且国内对该动物模型的疾病发展过程报道较少[1-2]。本研究旨在探究单纯烟雾暴露建立COPD大鼠模型的方法，并拟通过动态评价肺组织病理学改变、肺功能指标、支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数等观察COPD发展过程，为COPD动物模型的建立提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠24只，雄性，周龄8周，体质量(202±5)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司〔SCXX(沪)：SCXX(沪)2012-0002〕，饲养于南京军区福州总医院比较医学科SPF级动物实验室〔SYXX(闽)2013-0004〕，所用饲料、水、垫料均经过严格灭菌处理，并按照动物实验的3R原则给予人道关怀。

1.2 试剂及仪器 红梅(软黄)香烟由红塔烟草(集团)有限责任公司生产，包含焦油量12 mg、烟气烟碱量1.1 mg、烟气一氧化碳量13 mg；自制玻璃染毒箱(见图1)：大小80 cm×70 cm×60 cm，玻璃箱1/2处有一玻璃隔层，隔层上有16个孔均匀分布，顶端有一直径5 cm的圆孔，前面是一可推拉的玻璃门，玻璃箱下1/2处放置一电风扇；RPMI 1640培养基(HyClone，美国)，小鼠灌胃针，细胞离心涂片机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)；自制气管插管：临床用一次性输液器，使用时在细端1 cm处剪断，剪切面的角度为15°。

注：A为示意图，B为实图

1.3 实验分组及处理 大鼠正常饲养7 d无异常后进行分组。将24只大鼠随机分为对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组、烟雾暴露12周组，每组6只。将烟雾暴露组大鼠放在自制玻璃染毒箱的隔层上，可自由活动、进食、饮水，在玻璃箱下1/2处点燃香烟，1 h/次，2次/d，每次间隔5 h以上，5 d/周。香烟量随着周数增加而增多，第1周为9支/次、第2周为12支/次、第3周为15支/次、第4～12周为20支/次。对照组大鼠同时放在另一自制玻璃染毒箱中，自由呼吸空气。

1.4 肺功能指标测定方法 实验结束后各组大鼠采用3%戊巴比妥钠(110 mg/kg)进行腹腔麻醉，麻醉满意后分离气管，在第3、4气管环中间做一倒“T”形切口，将自制气管插管插入气管中，用手术缝合线系紧，放入体描箱，将气管与体描箱气路相连，并以相当于潮气量3倍的气量充气造成深吸气，然后立即放开，连接负压〔-10 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)〕抽气造成深呼气。计算机通过容积变化计算0.3秒用力呼气容积与用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)、吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)及肺动态顺应性(Cdyn)。

1.5 支气管肺泡灌洗炎性细胞计数方法 测定完肺功能指标后，腹主动脉放血处死大鼠，采用小鼠灌胃针气管插管至右主支气管，并结扎左主支气管，向右肺灌注无血清的RPMI 1640培养基5 ml，同时按摩肺脏30 s后回收，重复8次，回收率为90%。将回收的支气管肺泡灌洗液置于尖底离心管中，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液。加入1 ml RPMI 1640培养基重悬细胞，充分吹打混匀。取10 μl细胞悬液，采用血球计数板进行总细胞计数；另取100 μl细胞悬液，采用细胞离心涂片机进行涂片，自然干燥，瑞士染色后进行炎性细胞分类计数。

1.6 肺组织病理学检查方法 支气管肺泡灌洗后，结扎右主支气管，松开左主支气管，并注入4%多聚甲醛至左肺膨胀，随后在左肺大径处取大约3 mm厚组织块，采用4%多聚甲醛固定72 h，石蜡包埋，3 μm切片，常规HE染色，通过光学显微镜进行观察。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠整个实验过程中活动正常，毛发白亮细密，精神佳，无气促、发绀，食量好；烟雾暴露8周组大鼠活动减少，倦卧，毛发黄涩无光泽；烟雾暴露10周组大鼠活动进一步减少，精神不佳，毛发黄涩，食欲下降，间歇咳嗽偶有喘息；烟雾暴露12周组大鼠活动较烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组大鼠减少，精神萎靡，毛发枯糙发黄脱落，口唇及指抓发绀，消瘦。

2.2 肺功能指标 4组大鼠FEV0.3/FVC、Ri、Re及Cdyn比较，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、烟雾暴露8周组和烟雾暴露10周组大鼠FEV0.3/FVC、Ri、Re比较，差异无统计学意义(P>0.05)；烟雾暴露12周组大鼠FEV0.3/FVC和Cdyn低于对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组，Ri和Re高于对照组、烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组，差异有统计学意义(P<0.05)；烟雾暴露8周组和烟雾暴露10周组大鼠Cdyn低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 4组大鼠肺功能指标比较

2.3 支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数结果 4组大鼠支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数、巨噬细胞分数及中性粒细胞分数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；但4组大鼠淋巴细胞分数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾暴露8周组、烟雾暴露10周组、烟雾暴露12周组大鼠炎性细胞计数和中性粒细胞分数高于对照组，巨噬细胞分数低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 4组大鼠支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数结果比较

2.4 肺组织病理学检查结果 肺组织病理学检查结果显示，对照组大鼠支气管和肺泡结构清晰，气道黏膜上皮细胞排列整齐，肺泡大小均匀(见图2A、2B)；烟雾暴露8周组大鼠肺组织以炎性细胞浸润为主(见图2C、2D)；烟雾暴露10周组大鼠肺组织炎性细胞浸润更明显，气管壁平滑肌、纤维结缔组织增生，可见少许肺泡壁破坏(见图2E、2F)；烟雾暴露12周组大鼠气道上皮脱落，气道内黏液和细胞阻塞，肺组织结构破坏明显，肺泡扩张，肺泡间隔断裂，相邻肺泡融合形成肺大泡，小血管壁增厚(见图2G、2H)。

注：A、B为对照组大鼠肺组织病理学检查结果，C、D为烟雾暴露8周组大鼠肺组织病理学检查结果，E、F为烟雾暴露10周组大鼠肺组织病理学检查结果，G、H为烟雾暴露12周组大鼠肺组织病理学检查结果

3 讨论

临床研究结果显示，香烟烟雾暴露建立的COPD动物模型能够模拟人类COPD相似的病理改变[1-2]。国内外许多研究者在不同的实验条件下建立了烟雾暴露COPD大鼠模型，但至今该造模方法尚未成熟，主要表现为动物暴露装置、烟雾暴露时间、香烟支数和动物品种等方面尚未统一[2]，且国内该方面的研究报道甚少。目前，香烟烟雾暴露建立COPD动物模型较多用于COPD发病机制及新药物的研究，但烟雾染毒装置种类少且价格昂贵。由于经济条件有限许多实验室无法采购烟雾染毒装置，故本研究根据相关研究报道自制玻璃染毒箱[3-4]，并采用该装置成功建立单纯烟雾暴露COPD大鼠模型。本研究结果证实，自制玻璃染毒箱空间和通气孔足够，可保证大鼠自由活动、通气，还可有效避免实验动物窒息死亡，且制造价格低，因此该装置具有可行、安全、经济等优点，可适用于大多数实验室。据以往有关烟雾暴露建立COPD大鼠模型的报道，烟雾暴露时间为8～36周[1]，故本研究设置了8、10、12周3个时间点。

目前，COPD动物模型的成功标准主要依据肺组织病理学改变和肺功能改变，其中肺组织病理学改变主要如下：气道黏膜下腺体增生肥大、分泌功能亢进，周围大量炎性细胞浸润、黏液分泌增多，纤毛细胞变性坏死，杯状细胞增多、黏膜上皮局灶性增生及鳞状上皮化生，气道内可见细胞和黏液阻塞；肺内源性蛋白酶/抗蛋白酶失衡导致气道平滑肌和纤维结缔组织增生；肺内呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明显扩大，肺泡壁多处断裂，部分肺泡融合形成肺大泡，肺泡数量及大小也出现不同程度改变[5-8]。肺功能改变主要如下：存在气流阻塞、小气道阻力增高、Cdyn下降；气道重塑；伴有气道高反应性[9]。笔者认为一个符合临床实际的理想COPD动物模型应具备以下特点：致伤因素与临床COPD常见病因基本一致；存在COPD肺组织病理学改变；存在气流阻塞、小气道阻力增高、Cdyn下降等肺功能改变。烟雾是COPD的常见病因，本研究结果显示，随着单纯烟雾暴露时间延长大鼠肺组织出现了渐进性破坏，直至烟雾暴露12周大鼠出现了肺气肿和气道非特异性炎症等典型COPD组织病理学改变；同时肺功能指标显示，大鼠肺组织气道阻力增高、Cdyn下降，提示单纯烟雾暴露12周能复制出COPD动物模型。除此之外，本研究还观察了支气管肺泡灌洗液炎性细胞计数结果。有研究显示，支气管肺泡灌洗液细胞计数及分类能准确反映气道炎症，且COPD患者支气管肺泡灌洗液中炎性细胞以中性粒细胞为主[10]，本研究结果与之相符，进一步说明COPD动物模型建立成功。

临床研究显示，无呼吸道症状的吸烟者常规肺通气功能指标常在参考范围内，但小气道功能可能受损，且呼吸阻抗是判断气流阻塞的敏感指标[11]。但本研究结果显示，单纯烟雾暴露12周的大鼠Re、Ri才高于对照组，与以上研究结果不符，分析原因可能为大鼠的气道解剖结构与人类存在差异，大鼠缺少广泛的气管分支、无呼吸性细支气管[12]，故无法复制烟雾导致人类早期小气道损伤过程。黏液化生和气管腔内黏液过度分泌可导致气流受阻和管腔闭塞，从而增加气道阻力。本研究烟雾暴露12周组大鼠肺组织病理学检查结果显示大鼠气道内细胞和黏液阻塞，气道阻力增加，这与肺功能检查结果相一致。但由于实验室条件有限，本研究未对肺组织病理切片进行形态定量分析，仅通过显微镜观察肺组织病理学改变，故不能否定烟雾暴露8周组和烟雾暴露10周组大鼠未出现肺泡结构改变。

综上所述，在自制玻璃染毒箱单纯烟雾暴露12周可成功建立COPD大鼠模型，且建造COPD大鼠模型的过程能在一定程度上复制人类COPD的主要病理特征。

作者贡献：许能銮、陈愉生、陈小燕进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；陈小燕、陈正伟、黄文森、李鸿茹进行实验实施、评估、资料收集；许能銮进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：谢武英)

Methodological Study for Modelling Rat Model of COPD Caused by Simple Smog Exposure

CHENYu-sheng，CHENXiao-yan，CHENZheng-wei，HUANGWen-sen，LIHong-ru，XUNeng-luan.DepartmentofRespiratoryMedicine，FujianProvincialClinicalMedicineCollege(FujianProvincialHospital)，theFourthResearchLaboratoryforRespiratoryDiseaseofFujianProvince，Fuzhou350001，China

XUNeng-luan，DepartmentofRespiratoryMedicine，FujianProvincialClinicalMedicineCollege(FujianProvincialHospital)，theFourthResearchLaboratoryforRespiratoryDiseaseofFujianProvince，Fuzhou350001，China；E-mail：xnlldc@163.com

Objective To explore the model replicating methods of rat model of COPD caused by simple smog exposure.Methods A total of 24 Wistar rats were randomly divided into control group，8-week smog exposure group，10-week smog exposure group，12-week smog exposure group，each of 6 rats.Rats of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group were put in homemade glass box for infection，the frequency of smog exposure was 2 hours per day，5 days per week；rats of control group were put in other homemade glass box for infection with breathing the air.General conditions of the four groups were observed，index of pulmonary function，bronchoalveolar lavage fluid inflammatory cells count and pathology examination results of lung tissue were compared among the four groups.Results (1)General conditions：rats of control group performed normal activities during the experiment with white fine hair，good spirit and food intake，without anhelation or cyanosis；rats of 8-week smog exposure group performed less activity and tired of lying，with yellow unsmooth unglazed hair；rats of 10-week smog exposure group performed less activity and poor spirit，with yellow unsmooth hair and loss of appetite，intermittent cough and wheeze；rats of 12-week smog exposure group performed badly less activity than that of 8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group，with drooping spirit，dry rough yellow hair and alopecia，cyanosis of lips and fingernail，emaciation.(2)Index of pulmonary function：forced expiratory volume in 0.3 second and forced vital capacity ratio(FEV0.3/FVC)and pulmonary dynamic compliance(Cdyn)of 12-week smog exposure group were statistically significantly lower than those of control group，8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group，inhalation resistance(Ri)and exhalation resistance(Re) of 12-week smog exposure group were statistically significantly higher than those of control group，8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group(P<0.05)；Cdyn of 8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05).(3)Bronchoalveolar lavage fluid inflammatory cells count：inflammatory cells count and neutrophil percentage of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group were statistically significantly higher than those of control group，macrophage percentage of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of lymphocyte percentage was found among the four groups(P>0.05).(4)Pathology examination results of lung tissue：rats of control group showed clear bronchial and alveolar structure，regular arrange of airway mucosa epithelial cells and well-proportioned pulmonary alveoli；rats of 8-week smog exposure group showed infiltration of inflammatory cells；rats of 10-week smog exposure group showed obvious infiltration of inflammatory cells，hyperplasia of gas pipe wall smooth muscle and fibrous connective tissue with a little destroyed alveolar walls；rats of 12-week smog exposure group showed airway epithelial shedding，mucus and cell blocks in the airway，obvious damage of lung tissue structure，alveolar ectasia，alveolar interval rupture，pulmonary bullae formation and small vessel wall thickening.Conclusion 12-week simple smog exposure in homemade glass box for infection can successfully make the rat model of COPD.

Pulmonary disease，chronic obstructive；Smog；Rat；Models，animal；Methodology research

福建省自然科学基金(2014J01288)

350001福建省福州市，福建医科大学省立临床医学院(福建省立医院)呼吸内科(陈愉生，陈小燕，陈正伟，黄文森，李鸿茹，许能銮)；福建省呼吸四病研究室(陈愉生，李鸿茹，许能銮)

许能銮，350001福建省福州市，福建医科大学省立临床医学院(福建省立医院)呼吸内科，福建省呼吸四病研究室；E-mail：xnlldc@163.com

R 563.9

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.10.016

2016-07-12；

2016-10-12)

【编者按】 从科研设计之初，到科研实施与质量控制，再到科研成果报告，方法学研究均发挥着不可忽视的作用；方法学研究涵盖了流行病学调查方法、各种模型建立方法、调查量表制定与评价方法、数据统计与分析方法、临床指南实践方法、数据库建立与使用方法等。本期“方法学研究”栏目报道了陈愉生所在课题组采用单纯烟雾暴露建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型的方法，实用性强，可重复性好，具有较高的借鉴参考价值，敬请关注！