过氧化氢纳米雾灭菌技术用于GMP车间灭菌效果研究

刘万忠 张超 张杰

（湖北荷普药业股份有限公司，武汉 430048）

过氧化氢纳米雾灭菌技术用于GMP车间灭菌效果研究

刘万忠 张超 张杰

（湖北荷普药业股份有限公司，武汉 430048）

为了考察过氧化氢纳米雾灭菌技术对GMP车间洁净区的灭菌效果，采用两种不同的过氧化氢消毒液及不同的灭菌参数(不同的喷雾体积、不同的密闭时间）对灭菌效果进行验证。当所用消毒液的喷雾体积大于5 mL/m3时，过氧化氢纳米雾可以用于GMP车间洁净区灭菌，密闭90 min以上，即可达到对空间和表面的灭菌要求（即可杀死1×106的孢子）。

纳米雾；超干雾；GMP车间；灭菌

对GMP车间洁净区定期进行灭菌是保证生产产品质量的一个重要环节。目前在我国对空间进行灭菌的常用方法是比较传统的甲醛熏蒸法，甲醛的杀菌能力不容置疑，但是随着科学技术的发展，越来越受到专家质疑，因为甲醛是一级致癌物质。为了解决甲醛灭菌时间过长以及毒性和残留问题（会产生结晶状残留物），国内也有少数企业采用了汽化过氧化氢灭菌技术[1-5]，即VHP灭菌技术。汽化过氧化氢灭菌技术由于灭菌时间较短、无毒、无残留，且灭菌效果容易验证，广泛被欧盟国家认可。我国的GMP认证要与欧盟接轨，洁净区采用过氧化氢灭菌技术必然为大势所趋。但目前的 VHP灭菌技术成本较高，而且要采用高浓度的过氧化氢溶液（一般大于30 %），腐蚀性较强，特别是容易对彩钢板和环氧地面造成腐蚀。这就限制了这种灭菌技术在GMP车间大规模使用。

为了克服上述缺点，我们采用纳米雾灭菌技术对GMP 车间的灭菌效果进行了研究，结果如下。

1 试剂与仪器

（1）生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，孢子量106CFU/片，含同一批号生物指示剂专用培养液）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）。

（2）活性过氧化氢消毒剂（过氧化氢浓度6 %）。

（3）活性氧免洗消毒液（过氧化氢浓度1.5 %）。

（4）GY-02型过氧化氢气体浓度探测器。

（5）NMW-1型纳米雾TM消毒灭菌仪。

（6）试验场地：某GMP车间，洁净区高 2.8 m、宽 4.4 m、长 6.5 m，空间总体积约 80 m3。

2 使用流程

整个过氧化氢纳米雾灭菌过程分为8个阶段，流程如下。

（1）将设备带入洁净区前 ，先将设备表面灰尘用75 %酒精或者0.5 %活性过氧化氢消毒液擦拭清除干净；

（2）设置电子时控智能开关的自动开机时间和关机时间；

（3）根据洁净区域空间的大小，计算消毒液的雾化体积，或者根据雾化速度计算雾化开始和结束时间；

（4）通过漏斗向雾化微粒出口（消毒液注入口）将消毒液加入至设备的储液器中；

（5）将配备的万向喷雾头插入设备的雾化出口内；

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（6）关闭房间内所有循环风机，接通电子时控智能开关电源，当到达设定的启动时间后设备即开始自动雾化消毒；

（7）当到达设定的关机时间后设备即停止雾化消毒，自动关闭电源后，密闭60～180 min；

（8）当达到规定的密闭时间后，开启空调系统通风通过洁净空气置换以排除房间内部残留的过氧化氢，从而使房间内空气中过氧化氢气体浓度低于职业允许暴露水平，0.001 ‰（1 ppm）。

3 实验方法

用NMW-1型纳米雾TM消毒灭菌仪对上述80 m3的洁净车间进行灭菌试验。根据洁净区空间大小，按照使用流程，分别采用6 %活性过氧化氢消毒液或者1.5 %活性氧免洗消毒液，采用不同的喷雾体积和密闭时间进行纳米雾灭菌试验。

雾化时将设备置于车间正中间，5片生物指示剂分别放置在车间中间（编号3）和四个不同角落（设备喷雾头前方两个角落点编号分别为1和2，设备喷雾头后方角落两个点编号分别为4和5），所有生物指示剂离地面的高度均为1 m，并充分暴露于空气中，当消毒液雾化完毕后，将房间密闭60～180 min，再排风60～120 min除去残留的消毒剂，使其达到安全水平（空气中过氧化氢浓度小于0.001 ‰），按无菌方法取出生物指示剂（芽孢条），放入对应编号的嗜热脂肪芽孢培养液中，按照所购生物指示剂的使用说明书，置于恒温培养箱中，在（56±1）℃培养24 h后观察。同时取同批生物指示剂1片作阳性对照。经过24 h的培养，若培养液变浑浊，颜色由紫色变为黄色则判定为阳性；若培养液澄清，颜色不变色则为阴性；继续培养至第7 d，如果培养液变为黄色，则判定为灭菌不合格；如果培养液仍为紫色，则判定为灭菌合格。

4 实验结果

4.1 消毒液用量对灭菌结果的影响

固定密闭时间为90 min，用6 %活性过氧化氢消毒液分别喷雾不同体积，试验空间灭菌效果，结果见表1所示。由表1可知，当6 %活性过氧化氢消毒液的雾化体积大于5 mL/m3时，即可满足灭菌要求。

表1 活性过氧化氢消毒液用量对灭菌结果的影响Tab.1 Effect of the dosage of activated hydrogen peroxide disinfectant on the results of sterilization

固定6 %活性过氧化氢消毒液的雾化体积为5 mL/m3，改变雾化后的密闭时间，试验灭菌效果，结果见表2所示。由表2可知，当消毒液雾化后的密闭时间大于90 min时，即可满足灭菌要求。

4.3 不同消毒剂浓度对灭菌结果的影响

分别选用了6 %活性过氧化氢消毒液（专用杀孢子剂）和1.5 %活性氧消毒液2种不同浓度的消毒剂进行空间灭菌试验，固定密闭时间为90 min和雾化体积为5 mL/m3，结果见表3所示。由表3可知，当雾化体积为5 mL/m3，密闭时间为90 min时，2种消毒剂均可满足灭菌要求。

4.4 对表面的灭菌效果

采用 6 %活性过氧化氢消毒液进行纳米雾空间灭菌，喷雾体积为 5 mL/m3，密闭时间为 90 min。灭菌完毕后，采用无菌棉签擦拭灭菌后洁净区内各表面（4个墙面各2个点、地面随机选8个点），每个点的擦拭面积为5×5 cm2，擦拭完后，用无菌手术剪刀把棉签的头部（棉花部位）剪断，投入装有50 mL 0.9 %无菌氯化钠溶液的锥形瓶中并密闭。将装有样品的锥形瓶反复振摇，使棉签上的微生物释放到溶液中。取样品溶液，用薄膜过滤法过滤后，取出滤膜，含菌面朝上，贴于TSA培养基上，30～35℃培养5 d，计数并与灭菌前的检测结果进行对比。结果见表4所示。由表4可知，当雾化体积为5 mL/m3，密闭时间为90 min时，过氧化氢纳米雾灭菌技术不仅可以用于空间灭菌，而且还可对物体表面进行灭菌，灭菌后，墙壁和地面的表面微生物水平均符合GMP的要求。

表2 密闭时间对灭菌结果的影响Tab.2 Effect of sealing time on the results of sterilization

表3 活性过氧化氢消毒剂的浓度对灭菌结果的影响Tab.3 Effect of the concentration of activated hydrogen peroxide on the results of sterilization

表4 灭菌前后微生物污染水平的比较Tab.4 Comparison of microbial contamination levels before and after sterilization

4.5 过氧化氢残留量的测定

灭菌结束后用通风60～120 min，在房间的不同部位（与生物指示剂放置位置相同）用GY-02型过氧化氢气体浓度探测器对过氧化氢的残留量进行检查，结果均小于＜0.001 ‰（见表5所示）。

表5 过氧化氢的残留量检测结果Tab.5 Detection results of residual hydrogen peroxide

5 结束语

（1）过氧化氢纳米雾灭菌技术是近年来发展起来的一种新型空间灭菌技术[6-7]，它将分离干燥技术和文丘里原理相结合，可将消毒液雾化并进行分离干燥至1 μm以下的干燥小微粒，这种干燥的消毒剂小微粒能够长时间悬浮在空气中作无规则的布朗运动，从而保证了消毒剂与空气中的微生物充分接触而达到灭菌的目的。同时由于这种干燥的小微粒在接触物体表面后会产生反弹作用，不会像湿颗粒一样会凝结在一起形成液膜或液滴，因而不会润湿被消毒灭菌的物体表面而产生腐蚀，特别是对彩钢板和环氧地面没有腐蚀作用，是目前用于各种可密闭空间和各种人造设备的一种比较理想的灭菌技术。

（2）本研究采用采用湖北荷普药业股份有限公司生产的NMW-1型过氧化氢纳米雾TM消毒灭菌仪以及6 %活性过氧化氢消毒剂（专用杀孢子剂）和1.5 %活性氧免洗消毒液对GMP车间进行灭菌试验，并用生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，孢子量106）进行验证，结果均能使芽孢下降六个对数，满足灭菌要求，且灭菌后过氧化氢残留浓度也符合要求。

（3）过氧化氢纳米雾灭菌技术目前已用于数家制药企业GMP车间的灭菌，均取得了比较满意的结果。

（4）纳米雾灭菌技术设备结构简单、价格低廉，仅为目前VHP灭菌设备市场价格的十分之一，不仅可以用于空间灭菌，而且还可以同时对物体表面如地面和墙壁进行灭菌，取得了一举两得的灭菌效果。而传统的表面灭菌方法均是利用大量消毒液对物体表面进行擦拭，不仅浪费人力物力，还不能完全达到灭菌的效果。

（5）消毒剂（杀孢子剂）的具体用量应根据待灭菌的空间布局进行适当调整，当空间布局比较复杂（如含有大量设备影响空气流通）时可适当增加杀孢子剂用量，反之则适当减少杀孢子剂用量。

（6）空气过分潮湿会对灭菌效果产生一定的影响，建议使用时保持空气相对湿度小于75 %，必要时要对待灭菌的空间进行除湿处理。

[1]史云. 汽化过氧化氢（VHP）常温灭菌系统的应用探讨[J]. 医药工程设计，2011，32（3）：12-14.

[2]Michelle Finnegan，Ezra Linley，Stephen P. Denyer et al. Mode of action of hydrogen peroxide and other oxidizing agents：differences between liquid and gas forms[J]. J Antimicrob Chemother 2010，65： 2108–2115.

[3] 丁晓玥，梁毅. 国外汽化过氧化氢（VHP）低温灭菌系统的最新动态观察与探讨[J]. 机电信息，2010，272（26）：45-47.

[4]陈琦. 气化过氧化氢的灭菌技术及其验证分析[J]. 机电信息，2016，467（5）：41-48.

[5]郁朝阳. 汽化过氧化氢灭菌技术及其在动物设施消毒中的应用[J]，医药工程设计 2012，33（2）：49-53.

[6]刘万忠，别明仿，张超. 一种超干雾发生器： 201610058240.6 [P]．2016.05.25.

[7]刘万忠，别明仿，张超. 一种雾化喷头： 201610149887.X [P]. 2016.06.01.

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Study of Effects of Using Hydrogen Peroxide Nano Fog in Sterilization for GMP Workshop

Liu Wanzhong, Zhang Chao, Zhang Jie
（Hubei Hope Pharmaceutical Co., Ltd, Wuhan 430048）

In order to examine the sterilizing effect of hydrogen peroxide nano technology sued in cleaning area in GMP workshop, two different sterilizing liquids of hydrogen peroxide and different sterilization parameters were used. It was concluded that when the volume of sterilizing liquid fog is larger than 5 mL/m3and the space is sealed above 90 min, hydrogen peroxide nano can be applied to sterilizethe cleaning area in GMP workshop, that is, the sterilization requirements for space and surface can be met.

nano fog; super-dry fog; GMP workshop; sterilization

TQ460.8+2

A

2095-817X（2016）06-0030-004

2016-05-24

刘万忠（1964—），男，副主任技师，主要从事消毒剂和消毒设备等方面的研究工作。