藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比较

刘熠杭，马玉杰，商艳君，尹健铎

(1.河北省石家庄市第一中学，河北石家庄 050010；2.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050061)



藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比较

刘熠杭1，马玉杰2*，商艳君2，尹健铎2

(1.河北省石家庄市第一中学，河北石家庄 050010；2.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050061)

[目的] 比较藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性。[方法] 采用福林酚法进行酚含量的测定，抑菌圈法进行抗细菌活性测定，菌饼法进行抗真菌活性测定，并采用DPPH法进行抗氧化活性测定。[结果] 藤茶泡水前后乙醇提取物的多酚含量分别为168和56 kg/g，藤茶泡水前乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰葡萄孢霉、胶孢炭疽菌和葡萄白腐病菌均有抑制作用，泡水后的乙醇提取物对枯草芽胞杆菌不再有抑制作用，对其他5种菌仍有抑制活性但活性均有不同程度的降低。藤茶泡水前乙醇提取物的DPPH清除活性IC50分别为5.09和36.01 μg/mL。[结论] 藤茶泡水后的残渣仍具有一定的抗菌和抗氧化活性，可被继续开发利用。

藤茶；抗细菌活性；抗真菌活性；抗氧化活性；总酚含量

藤茶又名长寿茶，是我国民间比较广泛使用的代茶饮料，同时又是一味传统中药材，其原植物为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)[1-2]。作为药用植物资源，藤茶是一种极具开发潜力的中草药。藤茶中多酚含量高(在20%左右)，多酚类化合物具有广泛的生理活性[3]。近代医学研究表明，藤茶及其提取物具有增强和调节免疫、降血脂、降血压、降血糖、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗氧化、保肝、护肝以及减轻乙醇中毒等功效[4-5]。无论作为饮品、保健品还是药用植物资源，藤茶均具有较高的开发利用价值。目前有大量关于藤茶抗菌活性和抗氧化活性的报道[6-9]，但关于藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比较的研究还鲜见报道。该试验通过比较藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性差异，旨在为藤茶残茶的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。藤茶购自市场。细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(EscherichiaColi),均来自河北经贸大学微生物学实验室。真菌：灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)，均来自中国农业科学院植物保护研究所。

1.1.2 试剂。水杨酸、硫酸锂、钨酸钠、钼酸钠、磷酸溶液、浓盐酸溶液、Na2CO3溶液、维生素C、95%酒精、福林酚试剂、没食子酸、去离子水、DPPH等。

1.1.3 仪器。旋转蒸发仪、水浴锅、超净工作台、紫外分光光度计(7230G可见分光光度计)等。

1.2 方法

1.2.1 粗提取提取方法。泡水前后(应用后茶叶为泡水3次后茶叶)干燥的藤茶，用95%乙醇浸提3次，每次1 d，合并减压蒸干得乙醇粗提取物。

1.2.2 总酚含量测定。

图1 总酚标准曲线Fig.1 Calibration curve of total phenolic

1.2.2.1 标准曲线的绘制。精密称取 5 mg的没食子酸对照品，置50 mL容量瓶用蒸馏水溶解并定容，得0.1 mg/mL的标准溶液。分别取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL 棕色容量瓶中，加蒸馏水补至10 mL，摇匀，再加1 mL 的 Folin-Ciocalteu 试剂，充分摇匀。1 min后，加入7.5%(W/V)碳酸钠溶液 2 mL，混匀，用蒸馏水定容，在50 ℃水浴加热15 min，于765 nm处测定吸光度[10]。标准曲线见图1，得出回归方程为：y=143.24x+ 0.037 8(R2= 0.998)。1.2.2.2 藤茶乙醇提取物多酚含量的测定。取1 mL样品液加至10 mL比色管中，依次加入1 mL去离子水，后面同“1.2.2.1”方法，在765 nm下测定其吸光度。酚含量根据标准品没食子酸标准曲线确定的方程进行计算。

1.2.3 抗细菌活性。

1.2.3.1 抑菌圈的测定。采用打孔法进行测定。每皿加入约25 mL冷却至50～60 ℃灭菌后的牛肉膏蛋白培养基，凝固后，取0.1 mL(1×106～1×107CFU/mL)菌悬液加到平板培养基表面，涂布均匀。用打孔器(直径为0.8 cm)在涂布均匀的平板上打孔，无菌牙签挑取上层培养基。每孔加入100 μL样品(100 mg/mL)，每样品3个平行板，37 ℃倒置培养24 h，观察抑菌圈。测量抑菌圈的直径时，十字交叉，分别测量后，取平均值。取3次测量的平均值。青霉素为阳性对照(5 mg/mL)。

1.2.3.2 最小抑菌浓度的测定。制备菌体浓度为107CFU/mL的菌悬液，放置4 ℃冰箱，备用。测定时，与适量的液体细菌培养基混匀至细菌终浓度约为105CFU/mL。将甲醇溶解的不同浓度的样品100 μL和指示菌100 μL加入96孔细胞板中，37 ℃培养24 h，肉眼观察，无肉眼可见菌生长的最小的样品浓度即为样品对该菌的最小抑菌浓度(Mininum inhibitory concentration，MIC)。未加待测样品只含指示菌的为阴性对照，只含培养基的为空白对照，阳性对照用青霉素。

1.2.4 抗真菌活性。将200 mg提取物溶解到1 mL甲醇中，在PDA培养基冷却至50～60 ℃，将待测溶液加入至100 mL培养基中，充分摇匀，迅速倒入无菌培养皿中(每皿20 mL)，放置待其凝固。将供试病原真菌接到PDA平板上，28 ℃培养4 d，在培养皿边缘菌丝生长旺盛处用打孔器打取直径为

0.8 cm的菌饼。待测样品对真菌的抑制作用采用菌丝生长速率法[11]。用接种针将0.8 cm的菌饼接至带药培养基上，有菌丝的一面向下与培养基贴合，每个培养皿中中央接一个菌饼，28 ℃培养4 d后，用十字交叉法测菌落直径，计算相对抑制率。试验设空白对照、阳性对照(克霉唑，浓度为0.10 mg/mL)、加药处理(泡水前后的藤茶乙醇提取物，浓度为1 mg/mL)，每个处理设3个重复。相对抑制率的计算公式为：

1.2.5 抗氧化活性研究。DPPH自由基清除活性的测定参照文献[12-13]，用酶标仪在517 nm 下测量吸光度(A)。水溶性抗氧化剂VC为阳性对照。DPPH自由基清除活性计算公式[14]如下：

式中，A对照为对照的吸光值，A样品为加样品反应液的吸光值。每个样品测3次，取平均值。IC50是清除率为50%时对应的样品浓度，值越大，表明清除活性越弱；反之，越强。

2 结果与分析

2.1 藤茶泡水前后乙醇提取物的总酚含量 泡水前后藤茶乙醇提取物的多酚含量差异比较明显，分别为168和56 kg/g，表明藤茶具有较高含量的多酚，且泡水后的残茶仍有一定的多酚存在。

2.2 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗细菌活性比较 从表1可看出，泡水前藤茶乙醇提取物在浓度为100 mg/mL时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制活性大于浓度为5 mg/mL 的青霉素。藤茶泡水后乙醇提取物(100 mg/mL)抑菌活性小于青霉素(5 mg/mL)。藤茶泡水前后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑制活性，且泡水前乙醇提取物的抑制活性大于泡水后乙醇提取物，泡水后乙醇提取物对枯草芽胞杆菌无抑制活性。

表1 藤茶泡水前后乙醇提取物抗细菌活性

2.3 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗真菌活性比较 从表2可看出，藤茶泡水前后对3种葡萄植物病原菌均有一定的抑制活性。藤茶泡水前对葡萄白腐病菌和灰葡萄孢霉有较好的抑制活性，在浓度为1 mg/mL时抑制率分别为75.5%和82.8%，低于0.10 mg/mL的阳性对照制霉菌素。藤茶泡水后的乙醇提取物对葡萄白腐病菌和灰葡萄孢霉仍有很好的抑制活性，在浓度为1 mg/mL时抑制率分别为49.0%和55.5%。2.4 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗氧化活性比较 由图2可知，藤茶泡水前乙醇提取物具有很明显的清除作用，其IC50值为5.09 μg/mL与VC差异不显著(P>0.05，5.04 μg/mL)，且呈量效关系，藤茶泡水后其乙醇提取物仍具有一定的DPPH清除活性，其IC50为36.01 μg/mL。

表2 藤茶泡水前后乙醇提取物抗真菌活性

图2 藤茶泡水前后乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH radical scavenging ability of the ethanol extract of Ampelopsis grossedentata before and after soaking in water

3 结论

比较藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性发现，藤茶泡水前后乙醇提取物的多酚含量分别为168和56 kg/g；藤茶泡水前乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰葡萄孢霉、胶孢炭疽菌和葡萄白腐病菌均有抑制作用，泡水后的乙醇提取物对枯草芽胞杆菌不再有抑制作用，对其他5种菌仍有抑制活性但活性均有不同程度的降低；藤茶泡水前乙醇提取物的DPPH清除活性IC50分别为5.09和36.01 μg/mL。表明藤茶泡水后的乙醇提取物仍

具有一定的抗菌和抗氧化活性。参考文献

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Antimicrobial Activity and Antioxidant Activity Comparison ofAmpelopsisgrossedentatabefore and after Soaking in Water

LIU Yi-hang1, MA Yu-jie2*, SHANG Yan-jun2et al

(1.Shijiazhuang No.1 High School, Shijiazhuang, Hebei 050010;2.College of Biology Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang, Hebei 050061)

[Objective] To compare antibacterial activity and antioxidant activity of ethanol extracts fromAmpelopsisgrossedentatabefore and after soaking in water.[Method]The folin-ciocalteu method was used to make the total phenolic content, antibacterial and antifungal activities were done by the inhibition zone method and the fungus cake method respectively, and antioxidant activity was done by DPPH method.[Result]The total phenolic contents of ethanol extract ofAmpelopsisgrossedentata(EEAG) before and after soaking in water were 168 and 56 kg/g. EEAG before soaking in water showed antimicrobial activity againstEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Botrytiscinerea,ColletotrichumgloeosporioidesandConiothyriumdiplodiella. EEAG after soaking in water exhibited no antimicrobial activity against Bacillus subtilis and lower antimicrobial activities against the other five microbes. TheIC50values of DPPH radical scavenging ability of EEAG before and after soaking in waer were 5.09 and 36.01 μg/mL respectively.[Conclution]There are certain antimicrobial and antioxidant activities of the residue ofAmpelopsisgrossedentataafter soaking in water, so it should still be exploited.

Ampelopsisgrossedentata; Antibacterial activity;Antifungal activity;Antioxidant activity;Total phenolic content

2016年博士科研启动经费(0112160225)；2014省教育厅项目(2311002027)。

刘熠杭(2000-)，女，河北石家庄人，高中生。*通讯作者，硕士研究生，研究方向：天然产物的分离与提取。

2016-09-30

S 567.9;R 284.1

A

0517-6611(2016)33-0113-03