封丘产金银花不同提取物的体外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

朱小峰，朱晓娣，王金梅#[.河南大学中药研究所，河南开封 475004；2.赛诺菲（中国）投资有限公司上海分公司，上海 200040]

封丘产金银花不同提取物的体外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

朱小峰1，2＊，朱晓娣1，王金梅1#[1.河南大学中药研究所，河南开封 475004；2.赛诺菲（中国）投资有限公司上海分公司，上海 200040]

目的：考察封丘产金银花不同提取物的体外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法：以30%乙醇提取金银花得总浸膏，用水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得相应部位萃取物。采用1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基、2，2′-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）自由基清除试验和Fe3+还原/抗氧化能力试验考察金银花不同提取物的体外抗氧化活性大小[分别以半数清除浓度（IC50）和Trolox当量反映]；并考察4种不同提取物的体外凝血和抑制α-葡萄糖苷酶的活性强弱。结果：4种提取物中，乙酸乙酯部位抗氧化能力最强，ABTS、DPPH自由基的IC50分别为9.22、25.23µg/ml，Trolox当量为（2 480.80± 5.51）μmol/g；水提物部位促凝血活性最强、正丁醇部位抗凝血活性最强，血浆复钙时间分别为（210.28±2.19）、（149.20±1.25）s；总浸膏、乙酸乙酯部位均对α-葡萄糖苷酶活性有较强的抑制作用，复筛IC50分别为378.61、451.45 μg/ml。结论：封丘产金银花有较好的体外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性，可进一步开发。

金银花；封丘；抗氧化；凝血；α-葡萄糖苷酶；体外

金银花（Lonicerae japonicae Flos）为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花[1]，始载于《名医别录》，被列为上品。其性寒、味甘，具有清热解毒、凉散风热之功，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等证[2]，为临床常用中药。研究表明，金银花中的活性成分包括挥发油、黄酮、三萜皂苷、有机酸等，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、降血脂等多种生物活性[3]。

我国金银花资源丰富，传统以河南所产“南银花”和山东所产“东银花”质量最好，为道地药材。河南新密、封丘为“南银花”主产区，其中，封丘产金银花中绿原酸和木犀草苷含量均高于新密产金银花[4]，居全国各地金银花之首，并于2003年 1月获得国家质量监督检验检疫总局颁发的原产地标记注册证。文献调研发现，目前对封丘产金银花的研究较少，仅田野[5]对其进行了系统的化学成分研究，但并未结合生物活性。本研究拟研究封丘产金银花的体外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制作用，为封丘产金银花资源的开发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

AL104电子天平、DELTA 320 pH计（美国Mettler-Toledo公司）；LABOROTA 4000旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Electron公司）；LRH-150恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基（日本东京化成工业株式会社，批号：D0909，纯度：90%）；2，2′-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）、三吡啶三哑嗪（TPTZ）（美国Fluka公司，批号：101112411、1306929，纯度：均不低于99.0%）；6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧（Trolox，美国Aldrich公司，批号：10327AD，纯度：97.0%）；没食子酸丙酯（PG，批号：A019043001，纯度：98%）、丁基羟基茴香醚（BHA，批号：A019438801，纯度：96%）、二丁基羟基甲苯（BHT，批号：A020158601，纯度：99%）均购自比利时Acros Organics公司；α-葡萄糖苷酶（批号：129K1426，活力：194 U/mg）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，批号：026K1516，纯度：≥99.0%）、阿卡波糖（批号：16869，纯度：≥99.0%）均购自美国Sigma公司；维生素K1注射液（批号：1108023，规格：1 ml∶10 mg）、2.775 g/L氯化钙溶液（批号：1109051）均购自天津药业集团新郑股份有限公司；注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，批号：20110202，规格：20 mg/瓶）；其余试剂均为分析纯。

1.3 药材

金银花于2012年7月采集于河南省封丘县，由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为忍冬科（Caprifoliaceae）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，标本现存于河南大学中药研究所。

1.4 动物

獭兔，♂，体质量2.0～2.5 kg，由河南大学中药研究所提供（合格证号：医动字09-1-2号）。

2 方法

2.1 金银花不同提取物的制备

取金银花1.0 kg，30%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压回收乙醇，得到总浸膏。将总浸膏分散于水中，用50%硫酸调溶液pH至2.0，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得相应部位萃取物。

2.2 体外抗氧化活性测定

2.2.1 Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）试验[6]将金银花30%提取物总浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物样品分别用甲醇制备成2 mg/ml的溶液，按需稀释成不同质量浓度的样品溶液。用微量移液器取0.2 ml样品或对照品（PG、BHT、BHA）溶液加入到3.8 ml新鲜制备的TPTZ工作液中，混匀，于37℃条件下反应30 min后用酶标仪测定其在593 nm波长处的吸光度，每份样品平行操作3次，取平均值。还原能力强弱以Trolox当量（每克样品相当于水溶性维生素E的微摩尔数）表示。

2.2.2 ABTS自由基清除试验[7]按“2.1”项下方法制备金银花不同提取物的溶液，按需稀释成不同质量浓度的样品溶液。用微量移液器取0.15 ml样品或对照品（PG、BHT、BHA）溶液加入到2.85 ml ABTS自由基工作液中，混匀，10 min后用酶标仪测定其在734 nm波长处的吸光度（A），每份样品平行操作3次，取平均值。计算ABTS自由基清除率：清除率（%）＝（A对照－A样品）/A对照×100%，其中A对照为ABTS自由基工作液在734 nm波长处的A值，A样品为样品或对照品与ABTS作用后并去除样品自身吸收后的A值。当样品初筛质量浓度为2 000 μg/ml时，若清除率≥50%，则进行复筛试验，即将样品配制成不同质量浓度，按上述方法测定清除率，用Origin软件绘制样品质量浓度与抑制率相关的曲线，求出半数清除浓度（IC50）；否则，不进行复筛试验。

2.2.3 DPPH自由基清除试验[6]按“2.1”项下方法制备金银花不同提取物溶液，按需稀释成不同质量浓度的样品溶液。用微量移液器取0.1 ml样品或对照品（PG、BHT、BHA）溶液加入到3.5 ml DPPH甲醇溶液（0.06 mmol/L）中，混匀，静置30 min后用酶标仪测定其在515 nm波长处的吸光度（A），每份样品平行操作3次，取平均值。计算DPPH自由基清除率：清除率（%）＝（A对照－A样品）/A对照×100%，其中A对照为DPPH自由基工作液在515 nm波长处的A值，A样品为样品与DPPH作用后并去除样品自身吸收后的A值。当样品初筛浓度为2 000 μg/ml时，若清除率≥50%，则进行复筛试验，即将样品配制成不同质量浓度，按上述方法测定清除率，用Origin软件绘制样品质量浓度与抑制率相关的曲线，求出IC50；否则，不进行复筛试验。

2.3 体外抗凝血活性测定

[8]，设定空白组、4个样品组（30%提取物总浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物）和2个阳性对照组（灯盏花素和维生素K1）。灯盏花素、维生素K1和各样品分别加入乙醇-丙二醇-注射盐水（2∶2∶6）溶液，超声振荡至溶解，制成质量浓度均为1 mg/ml的溶液。于兔耳缘静脉采血3.6 ml，加至含38 g/L枸橼酸钠400 μl的4 ml离心管中，混匀，离心后取血浆，备用。取1.5 ml道夫管，空白组加入血浆0.1 ml及空白溶剂0.1 ml；4个样品组分别加入血浆0.1 ml及30%提取物总浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物溶液各0.1 ml；2个阳性对照组分别加入血浆0.1 ml及相应药液0.1 ml。于37℃温育1 min后分别向每管加入2.775 g/L氯化钙溶液0.1 ml，计时，直到检测到纤维蛋白丝时停止计时，即为血浆复钙时间。维生素K1、灯盏花素对照组和空白组分别平行测定3次，4个样品组分别平行测定6次。结果以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析法（One-way ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.4 体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

2.4.1 酶活力测定 参照文献[9]，取96微孔板，每孔加入8 μl二甲基亚砜（DMSO）、112 μl磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）和40 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液20 μ（l溶于PBS缓冲液），振荡后于37℃温育15 min，然后加入2.5 mmol/L PNPG溶液（溶于PBS），振荡后于37℃温育15 min，再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μl，混匀。用酶标仪测定各孔在405 nm波长的光密度（OD）值。适量调整α-葡萄糖苷酶溶液浓度，使OD值在1.9～2.3之间，可进行样品抑制活性测定。

2.4.2 体外α-葡萄糖苷酶活力抑制能力测定 4个样品均用DMSO制备成质量浓度为30 mg/ml的溶液，按需用DMSO稀释成相应质量浓度的样品溶液。根据反应体系，加入8 μl样品溶液、112 μl PBS（pH 6.8）、20 μl α-葡萄糖苷酶溶液（40 U/ml），振荡后于37℃温育15 min，加入2.5 mmol/L PNPG溶液，振荡后于37℃温育15 min，再加入80 μl Na2CO3溶液（0.2 mol/L），用酶标仪测定其在405 nm波长下的光密度（OD）。同时设相同体系下不加酶的样品空白组、不加样品的空白对照组以及加阿卡波糖的阳性对照组。计算不同样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：酶活性抑制率（%）＝（OD样品+酶－OD样品）（/ODDMSO+酶－ODDMSO）×100%，当样品初筛质量浓度为1 500 μg/ml时，若抑制率≥50%，则进行复筛试验，即将样品配制成不同质量浓度，按上述方法测定抑制率，用Origin软件绘制样品质量浓度与抑制率相关的曲线，求出IC50；否则，不进行复筛试验。

3 结果

3.1 体外抗氧化活性测定结果

金银花水提物对Fe3+还原能力和清除ABTS、DPPH自由基的活性均不好；金银花乙酸乙酯部位的抗氧化能力在4个提取物中最强，其Trolox当量大于BHT，清除DPPH自由基的IC50值低于BHT；其次是总浸膏，但总浸膏的作用均弱于阳性对照，结果详见表1。

3.2 体外抗凝血活性测定结果

表1 金银花不同溶剂提取部位的抗氧化活性测定结果Tab 1 Antioxidant activity of different extracts from L.japonicae

总浸膏组与空白组比较血浆复钙时间差异无统计学意义（P＞0.05）；乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组与空白组比较血浆复钙时间显著缩短（P＜0.01），且与维生素K1组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，乙酸乙酯部位和正丁醇部位表现出较强的体外促凝活性。水提物组与空白组比较血浆复钙时间显著延长（P＜0.001），与灯盏花素组比较血浆复钙时间差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，金银花水提物表现出较好的体外抗凝活性。综上所述，具有促凝血作用的样品促凝顺序为维生素K1＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位；具有抗凝血活性的样品抗凝作用顺序为灯盏花素＞水提物，结果详见表2。

表2 金银花不同溶剂提取部位对体外血浆复钙时间的影响（±s，s）Tab 2 Effect of different extracts from L.japonicae on plasma recalcification time in vitr（o±s，s）

表2 金银花不同溶剂提取部位对体外血浆复钙时间的影响（±s，s）Tab 2 Effect of different extracts from L.japonicae on plasma recalcification time in vitr（o±s，s）

注：与空白组比较，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

30%乙醇提取物总浸膏乙酸乙酯部位正丁醇部位水提物空白组维生素K1灯盏花素6666333 191.88±8.98 153.80±7.69＊＊149.20±1.25＊＊210.28±2.19＊＊＊174.13±1.35 146.33±4.40＊＊215.55±5.30＊＊样品n 体外血浆复钙时间

3.3 体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果

金银花水提物对α-葡萄糖苷酶活性的体外抑制作用较差。在初筛质量浓度为1 500 μg/ml时，金银花30%乙醇提取物总浸膏和其乙酸乙酯部位的抑制率分别为108.09%、102.81%，均大于阳性对照阿卡波糖的52.74%；且其IC50分别为378.61、451.45 μg/ml，均小于阿卡波糖的1 358.34µg/ml。可见，金银花30%乙醇提取物总浸膏、乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶活性均有较强的抑制作用，且金银花乙酸乙酯部位效果要优于总浸膏，结果详见表3。

4 讨论

在前期研究[10]中，笔者从金银花30%乙醇提取物中的乙酸乙酯部位分离出5个化合物，经过结构鉴定分别为二十五烷醇、β-谷甾醇、5-羟基-7，4′-二甲氧基黄酮、α-D-葡萄糖和棕榈酸，其中二十五烷醇和α-D-葡萄糖首次从该属植物中分离得到。本研究采用体外抗氧化活性的测定、体外凝血活性的测定以及α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的测定，考察了金银花不同提取物的生物活性。其中，抗氧化试验选择常用的食品抗氧化剂PG、BHT、BHA作为阳性对照，这3种物质的Trolox当量和对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力均不同，可更加全面地评价金银花各样品的抗氧化活性。在体外凝血活性测定试验中，以临床常用的止血药物维生素K1（可促使肝脏合成凝血酶原）作为促凝血活性的阳性对照，以活血药物灯盏花素（具有抗血小板聚集作用）作为抗凝血活性的阳性对照，可分别评价金银花不同样品的促凝血或抗凝血活性。

表3 金银花各溶剂部位对体外α-葡萄糖苷酶活性的影响Tab 3 Effect of different extracts from L.japonicae on the activity of α-glucosidase in vitro

结果表明，金银花乙酸乙酯部位的抗氧化活性以及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均要优于其总浸膏、正丁醇部位及水提物；金银花水提物的抗凝血作用效果较好，而金银花的正丁醇部位的促凝血效果要优于乙酸乙酯部位，原因可能与金银花各部位所含的化学成分有关。刘慧琼等[11]研究半夏中β-谷甾醇的抗氧化作用发现，β-谷甾醇对氧自由基具有较强的抑制作用，对油脂也有较强的抗氧化作用。从金银花乙酸乙酯部位中分离出的化合物中含有β-谷甾醇和黄酮类化合物，因此根据本研究结果认为金银花乙酸乙酯部位的抗氧化活性较好，此观点与文献[11]相符。

综上，本研究体外活性实验结果表明，金银花具有一定的抗氧化、抗凝血及抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中以乙酸乙酯部位活性最强。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：221.

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2004：72、236.

[3] 宋卫霞.金银花水溶性化学成分研究[D].北京：中国协和医科大学，2008.

[4] 李建军，李军芳，梁建强，等.豫金银花指标成分的HPLC测定分析[J].广西师范大学学报：自然科学版，2012，30（2）：94.

[5] 田野.金银花化学成分研究[D].郑州：郑州大学，2007.

[6] 宋艳丽，康文艺.帽蕊木抗氧化活性研究[J].精细化工，2009，26（2）：150.

[7] 康文艺，李彩芳，宋艳丽.蝉翼藤抗氧化口山酮成分研究[J].中国中药杂志，2008，33（16）：1 982.

[8] 顾海鹏，王佳佳，顾雪竹，等.黑莓（萨尼）和红树莓（哈瑞特斯）对凝血作用的影响[J].河南大学学报：医学版，2013，32（1）：35.

[9] 康文艺，张丽，宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中国中药杂志，2009，34（4）：406.

[10] 朱小峰.金银花活性成分研究[D].开封：河南大学，2014.

[11] 刘慧琼，郭书好，沈英森，等.半夏中β-谷甾醇的抗氧化作用研究[J].广东药学院学报，2004，20（3）：281.

（编辑：林 静）

Study on in vitro Antioxidant，Anticoagulant and α-glucosidase Inhibitory Activities of Different Extracts of Lonicerae japonicae from Fengqiu

ZHU Xiaofeng1，2，ZHU Xiaodi1，WANG Jinmei1（1.Institute of TCM，Henan University，Henan Kaifeng 475004，China；2.Shanghai Branch，Sanofi（China）Investment Co.，Ltd.，Shanghai 200040，China）

OBJECTIVE：To investigate in vitro antioxidant，anticoagulant and α-glucosidase inhibitory activities of different extracts of Lonicerae japonicae from Fengqiu.METHODS：The total extract was obtained from L.japonicae by extraction with 30% ethanol，and dispersed in water，from which the extracts of corresponding parts were obtained after extraction successively with trichloromethane and ethyl acetate.The in vitro antioxidant activity of different extracts from L.japonicae[reflected by IC50，Trolox equivalent value]was investigated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical，2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）radical scavenging test and Fe3+reduction and antioxidant capacity test.The α-glucosidase inhibitory activity and coagulant activity of 4 extracts were also studied in vitro.RESULTS：The ethyl acetate extract of L.japonicae had the highest antioxidant activity among 4 extracts，IC50of ABTS and DPPH were 9.22，25.23µg/ml and Trolox equivalent value was（2 480.80± 5.51）μmol/g.Procoagulant activity of water extract and anticoagulation activity of n-butyl alcohol extract were the highest；the plasma recalcification time were（210.28±2.19）s and（149.20±1.25）s.Both total extract and ethyl acetate part inhibited the activity of α-glucosidase，and IC50of re-screening were 378.61，451.45 μg/ml.CONCLUSIONS：L.japonicae from Fengqiu have good antioxidant，anticoagulant and α-glucosidase inhibitory activities in vitro，and could be further developed and studied.

Lonicerae japonicae；Fengqiu；Antioxidant；Coagulant；α-glucosidase；in vitro

R284

A

1001-0408（2016）34-4804-03

2016-03-21

2016-08-09）

＊硕士。研究方向：中药化学。电话：0371-23880680。E-mail：zxfw0802@126.com

#通信作者：讲师，硕士。研究方向：中药活性成分研究。电话：0371-23880680。E-mail：wangjinmeiscp@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.16