纯康血脂胶囊对高脂血症大鼠肝脏黏附分子表达的影响

牛慧云，田彩云，杨玉梅，杜志强，任志生，杜晓红

（1.包头医学院第三附属医院药剂科，内蒙古 包头 014030；

2.包头医学院药学院·心血管研究室，内蒙古 包头 014040）

纯康血脂胶囊对高脂血症大鼠肝脏黏附分子表达的影响

牛慧云1，田彩云2，杨玉梅2，杜志强1，任志生1，杜晓红1

（1.包头医学院第三附属医院药剂科，内蒙古 包头 014030；

2.包头医学院药学院·心血管研究室，内蒙古 包头 014040）

目的 探讨纯康血脂胶囊对高脂血症大鼠肝脏细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）mRNA表达的影响。方法 将健康雄性SD大鼠40只随机分为4组，即空白组、模型组、辛伐他汀组及纯康血脂胶囊组，每组10只。高脂饲料饲喂3周建立高脂血症动物模型，纯康血脂胶囊组灌胃纯康血脂胶囊（0.5 g/kg），辛伐他汀组灌胃辛伐他汀混悬液（12 mg/kg），空白组、模型组灌胃等容量生理盐水，共9周。检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），采用半定量RT-PCR法测定大鼠肝脏ICAM-1，VCAM-1 mRNA的表达。结果 与模型组比较，纯康血脂胶囊组大鼠血清TC，TG，LDL-C水平显著降低（P＜0.05），肝脏ICAM-1，VCAM-1 mRNA表达均显著减弱（P＜0.01）。结论 纯康血脂胶囊可通过下调肝脏ICAM-1，VCAM-1 mRNA表达，调节高脂血症大鼠血脂水平。

纯康血脂胶囊；高脂血症；肝脏细胞间黏附分子；血管细胞黏附分子

高脂血症是引起心脑血管疾病的主要原因之一。目前，中药调血脂药物以其药源丰富、调脂作用温和、毒副作用小等优点，在高脂血症的防治中发挥着重要作用［1］。近年来，对高脂血症的试验研究已从简单的改善血脂异常涉及到分子水平。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）属免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子，是介导细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的糖蛋白，参与众多的病理生理过程，在炎症发生与发展中起着重要作用［2-4］。纯康血脂胶囊主要由荜茇、大黄、粉葛、蒲黄、何首乌等组方，是内蒙古蒙药技术研究工程中心研制的中药制剂。本研究中从分子水平探讨纯康血脂胶囊对试验性高脂血症大鼠肝脏ICAM-1及VCAM-1 mRNA表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、动物与试药

仪器与试剂：TG16-WS型台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；PTC-100TM型 PCR仪 Programmable Thermal Controller.MJ Research，InC）；Motic 6.0数码医学图像分析系统（厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司）。RT-PCR反转录试剂盒（Invitrogen，批号为 11904-018）；Taq酶（TaKaRa，批号为 R001A）；PCR试剂盒（TaKaRa）；TRIzol试剂盒（Invitrogen，批号为15596-026）。

动物：SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±50）g，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供，动物许可证号为SCXK（京）2009-0017。

药品：纯康血脂胶囊（内蒙古蒙药技术研究工程中心，批号为051012）；辛伐他汀片（苏州俞氏药业有限公司，批号为120107）。

1.2 模型建立

SD大鼠适应性饲养2 d后，随机分成4组，空白组、模型组、纯康血脂胶囊组、辛伐他汀组，除空白组给予普通饲料外，各组大鼠均喂饲高脂饲料，即胆固醇（4%）、胆酸盐（1%）、猪油（10%）、甲基硫氧嘧啶（0.2%）和基础饲料（84.8%），自由饮水，连续3周。

1.3 给药方法

造模成功后，继续喂饲高脂饲料并灌胃给药（20 mL/kg），每天1次，连续9周，纯康血脂胶囊内容物、辛伐他汀片分别用生理盐水溶解配成质量浓度为0.5 g/kg（相当于人临床等效量）、12 mg/kg（相当于人临床用量的20倍）的混悬液，正常对照组与高脂模型组给予等容量生理盐水，每周称量体重并按体重调整用药量。

1.4 血清血脂水平的测定

末次给药后禁食12 h，戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉取血5 mL，以3 000 r/min的速率离心10 min，分离血清备用，按说明书测定血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.5 肝脏ICAM-1及VCAM-1 mRNA表达的测定

末次给药后禁食12 h，放血处死大鼠，迅速解剖取出肝脏，于冷生理盐水中去除血液，同一位置切取一小部分肝脏置无RNA酶的冻存管中，液氮速冻后于-70℃冰箱冻存。

总RNA提取：相同部位取冷冻肝组织约100 mg加1 mL Trizol试剂匀浆，按 Trizol试剂操作方法提取总RNA用于逆转录，各总 RNA样本 A260/A280比值为1.8～2.0。

PCR扩增反应：1）RT-PCR扩增反应体系。结果见表1。2）RT-PCR扩增反应条件。95℃预变性3min→35个循环（95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s）→72℃终末延伸10 min。

表1 RT-PCR扩增反应体系

电泳：取PCR产物约8 μL，以1%琼脂糖凝胶电泳20～30 min，紫外灯下观察目的条带，凝胶成像分析系统成像后进行灰度扫描，以β-actin密度作为参考定量标准计算ICAM-1及VCAM-1 mRNA表达的相对量。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料用均数±标准差（）表示，组间比较用独立样本 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠血脂的影响

与空白组相比，模型组血清TC，TG，LDL-C均显著升高，HDL-C显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，纯康血脂胶囊组和辛伐他汀组TC，TG，LDL-C均显著降低，HDL-C显著升高（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠血脂水平比较（，mmol/L，n=10）

表2 各组大鼠血脂水平比较（，mmol/L，n=10）

注：与空白组比较，#P＜0.01；与模型组比较， P＜0.01。下表同。

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2.2 对ICAM-1，VCAM-1 mRNA的影响

由表3及图1可见，与正常对照组比较，高脂模型组ICAM-1，VCAM-1 mRNA表达均显著增强（P＜0.01）。与高脂模型组比较，纯康血脂胶囊组和辛伐他汀组ICAM-1，VCAM-1 mRNA表达均显著减弱（P＜0.01）。ICAM-1 cDNA，VCAM-1 cDNA PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

表3 各组高脂血症大鼠肝组织ICAM-1，VCAM-1表达情况比较（， -action，n=10）

表3 各组高脂血症大鼠肝组织ICAM-1，VCAM-1表达情况比较（， -action，n=10）

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3 讨论

目前，对高脂血症作用机理及病理生理的研究已深入到细胞和分子生物学水平。细胞黏附分子是一类由细胞产生的可介导细胞间、细胞与基质间的黏附的糖蛋白，以配体-受体相对应的形式发挥信息传递和受体功能的作用［5］。细胞黏附分子参与细胞信号的传导与活化、炎性反应、创伤愈合、血栓形成等一系列生理、病理过程。ICAM-1和VCAM-1在冠心病等病理过程中起着重要作用，细胞活化时，ICAM-1和VCAM-1的表达迅速上升，使内皮细胞易于“捕获”炎性细胞，并促进其迁入动脉壁，促进斑块内炎性反应。ICAM-1和VCAM-1通过介导白细胞、内皮细胞、单核细胞和T细胞的滚动和稳定黏附，在单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子的协助下穿越血管表层，启动局部的炎性反应［6］。

图1 基因电泳图

正常肝细胞不表达ICAM-1，窦内皮细胞和血管内皮细胞有微弱表达，VCAM-1可在内皮细胞特别是在细胞激动素刺激下在血管内皮上表达［7-8］，肝损伤时内皮细胞性粒细胞（PMN）介导细胞毒的主要物质，中性粒细胞与肝细胞ICAM-1黏附，通过释放氧自由基和蛋白酶发挥细胞毒作用，从而导致肝细胞坏死［9-10］。

高脂血症时肝内过量脂肪堆积、脂质过氧化、脂毒性反应和体内内毒素血症等激活肝星状细胞，促使其表达、合成和分泌肿瘤坏死因子等细胞因子，通过改变核转录因子-KB和蛋白激酶相关机制，使ICAM-1在肝内的表达上调［11］。反之，ICAM-1缺失或低表达可抑制中性粒细胞向肝细胞的黏附，从而减少肝细胞的损伤，研究证实，ICAM-1的表达水平与肝脏炎症严重程度呈正相关［12］。

VCAM-1广泛分布于细胞因子活化的内皮细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞及树突状细胞表面，炎症病理条件下其表达增多。VCAM-1通过与其特定配体VLA-4结合参与白细胞对内皮细胞的黏附，促进中性粒细胞、单核细胞及T淋巴细胞浸入肝实质，与炎症的发生及发展有密切关系［13］。VCAM-1的水平可反映血管内皮细胞的激活状态。研究显示，VCAM-1独立于经典的高危因素，是预测心血管病未来病死率最为显著而独立的标记物［14-15］。VCAM-1可能不仅促进中性粒细胞，而且也促进单核细胞及T淋巴细胞浸入肝实质，与炎症的发生及发展有密切关系。研究证明，不稳定型心绞痛及心肌梗死患者ICAM-1和VCAM-1的表达明显高于稳定型心绞痛患者，因此ICAM-1和VCAM-1表达水平与冠心病的严重程度相关［16］。大剂量他汀类药物可以降低黏附分子水平，使内皮细胞不易“捕获”白细胞，减少黏附分子介导的白细胞反应，减少血管壁和动脉粥样斑块的单核巨噬细胞浸润，增加纤维帽的稳定性，从而减缓斑块破裂的反应［17］。

综上所述，纯康血脂胶囊可显著降低高脂血症大鼠肝脏ICAM-1，VCAM-1表达，且降低VCAM-1表达与辛伐他汀无显著差异，提示纯康血脂胶囊可通过降低ICAM-1，VCAM-1在肝脏的表达，抑制中性粒细胞与肝细胞的黏附，从而发挥调节血脂的作用。

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Effect on the Expression of Adhesion Molecule in Hyperlipemic Rats Treated with Chunkang Xuezhi Capsules

Niu Huiyun1，Tian Caiyun2，Yang Yumei2，Du Zhiqiang1，Ren Zhisheng1，Du Xiaohong1
（1.Department of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou，Neimenggu，China 014030； 2.Department of cardiovascular research，school of pharmacy，Bao Tou Medical College，Baotou，Neimenggu，China 014030）

Objective To investigate the effect of Chunkang Xuezhi Capsules on ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression of hyperlipemic rats.M ethods 40 Wistar male rats were divided into 4 groups（10 rats in each group）randomly：blank group，model group，simvastatin group and Chunkang Xuezhi Capsules group.Hyperlipidemic rats were induced by hyperlipidemic diet for 3 weeks.The Chunkang Xuezhi Capsules group was intragastric administrated with Chunkangxuezhi suspensionl（0.5 g/kg daily），the simvastatin group was intragastric administrated with simvastatin suspension（12 mg/kg daily），and the rats in the blank group and the model group were intragastric administrated with equal volume of saline for 9 weeks.The expressions of ICAM-1 and VCAM-1 in hepatic tissue were measured by semi-quantitative RT-PCR.Results The serum levels of TC，TG and LDL-C in the Chunkang Xuezhi Capsules group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05），the expressions of ICAM-1 and VCAM-1 significantly lower than those in the model group（all P＜0.01）.Conclusion Chunkang Xuezhi Capsules can regulate the blood lipid levels of hyperlipidemic rats by reducing the expressions of ICAM-1and VCAM-1.

Chunkang Xuezhi Capsules；hyperlipidemias；ICAM-1；VCAM-1

R285．5；R286

A

1006－4931（2016）19－0033－04

牛慧云（1981-），女，汉族，硕士研究生，主要从事临床药学和药理学研究工作，（电子信箱）bfyyyjkzr@163.com；杨玉梅，硕士研究生，主要从事临床药学和药理学研究工作，本文通讯作者，（电子信箱）yym457@aliyun.com。

2016-06-01；

2016-07-03）