不同部位Ⅲ期结直肠癌的临床及错配修复基因表达的比较分析

陈万源 鞠海星 吴伟 胡锦林 李德川

不同部位Ⅲ期结直肠癌的临床及错配修复基因表达的比较分析

陈万源 鞠海星 吴伟 胡锦林 李德川

目的 探讨不同部位Ⅲ期结直肠癌患者的临床病理及错配修复基因表达的的差异。方法 应用En-Vision二步法检测340例结直肠癌中hMLH1、hMSH2和hMSH6的表达，并分析不同部位结直肠癌的临床病理及hMLH1、hMSH2、hMSH6的差异。结果 340例Ⅲ期结直肠癌中，右半结肠、左半结肠和直肠癌分别为60、68和212例，肿瘤侵润深度、肿瘤细胞分化程度在右半结肠、左半结肠和直肠癌中均有统计学差异（均P＜0.05），而患者年龄、性别、淋巴结转移数在不同部位肿瘤中均无统计学差异（均P＞0.05）。在右半结肠、左半结肠和直肠癌中hMLH1表达缺失率分别为13.4%、2.9%和5.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）；hMSH2分别为6.7%、1.5%和 4.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）；hMSH6分别为3.3%、2.9%和1.9%，差异无统计学意义（P＞0.05）；MMR（hMLH1+hMSH2+hMSH6）分别为23.3%、7.4%和11.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 不同部位的Ⅲ期结直肠癌中，其临床病理及hMLH1、hMSH2、hMSH6差异明显。

结肠直肠肿瘤 错配修复基因 免疫组织化学

结直肠癌是世界常见恶性肿瘤之一，我国结直肠癌的发病构成中，结直肠癌发病出现右移。10年前，直肠癌发病率一直高于结肠癌，近年来结肠癌高于直肠癌，这种变化可能是多种因素促成[1]。临床资料显示，Ⅲ期结直肠癌在所有结直肠癌中一直占有较高的比例[2]。由于左、右半结肠的解剖学结构和生理功能不同，其肿瘤发生机制也可能存在差异。错配修复基因（mismatch repair genes，MMR）缺陷引起微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）在林奇综合征发生中起主要作用，近年来研究表明，MMR对部分结直肠癌的诊断、药物选择及预后判断等具有重要意义，而在MMR中hMLHl、hMSH2及hMSH6起主要作用。MMR的突变缺失也参与散发性结直肠癌（sporadic colorectal cancer，SCRC），但其发病机制及临床意义尚未明确。为了探讨MMR表达缺失在SCRC肿瘤发生、发展中的作用，笔者采用免疫组化法检测SCRC中hMLHl、hMSH2及hMSH6的表达情况并分析其临床意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1对象 收集我院2013年2月至2015年8月间收治的Ⅲ期结直肠癌340例，男202例（59.4%），女138例（40.6%）；年龄27～89岁，中位年龄57岁。其中结肠癌128例，直肠癌212例。所有患者术前均未行放疗和化疗，均经过组织学证实，排除病理学分型为恶性淋巴瘤、神经内分泌瘤及间质瘤。

1.2 方法 hMLH1（G168-728）、hMSH2（FE11）及hMSH6单克隆抗体均购自Invitrogen公司；工作浓度hMLH1（1∶100），hMSH2（1∶200），hMSH6（1∶100）。标本经10%中性缓冲甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm切片；10mmol/ L pH6.0的柠檬酸缓冲液高压喷气修复抗原；采用En-Vision二步法，在半自动免疫组化仪上脱蜡、复染、脱水、显色。结果判断：hMLH1、hMSH2及hMSH6定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，参照Shia等评定标准[3]，只有全部肿瘤细胞核无hMLH1或hMSH2或hMSH6表达时为阴性，而弱染色（＜10%肿瘤细胞着色或核染色浅黄色）、异质性染色（阳性肿瘤细胞片块状分布）均不作阴性判读。以切片内癌旁正常肠黏膜上皮和（或）淋巴、纤维细胞作阳性内对照，TBS代替一抗作阴性对照。所有免疫组化染色结果由2位病理科医师复核。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，hMLHl、hMSH2及hMSH6表达与临床病理参数之间的比较采用χ2检验或精确概率法。

2 结果

340例不同部位Ⅲ期结直肠癌患者的临床病理见表1，在Ⅲ期结直肠癌中直肠癌占的比例明显多于结肠癌；不同的发病部位之间的肿瘤侵润深度、病理类型比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），而其他临床特征比较均无统计学差异（均P＞0.05）。免疫组化结果显示，340例结直肠癌中，hMLHl表达缺失22例（6.5%）（见图1），hMSH2表达缺失15例（4.4%）（见图2），hMSH6表达缺失8例（2.4%），其中1例直肠癌hMLHl、hMSH2表达均缺失；hMLHl表达缺失在右半结肠为8例（13.4%），明显高于左半结肠2例（2.9%）和直肠12例（5.7%），差异均有统计学意义（均P＜0.05），hMSH2在不同部位结直肠癌中的表达差异有统计学意义（P＜0.05），而hMSH6表达缺失在不同部位结直肠癌中的差异无统计学意义（P＞0.05）。同时结果显示，hMLH1+hMSH2+hMSH6表达缺失在右半结肠癌中共14例（23.3%），左半结肠癌5例（7.45%），直肠癌26例（11.8%），差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

图1 hMLH1表达缺失（HE染色）

图2 hMSH2表达缺失（HE染色）

3 讨论

MMR基因突变导致其蛋白表达产物产生缺陷而失去错配修复功能，引起MSI或DNA修复错误，增加细胞基因组的不稳定，引起细胞增殖及异常分化，最终导致多种肿瘤的发生。MMR基因突变作为林奇综合征的诊断依据已被公认，但MMR基因突变在SCRC中并不少见，Kim等[4]研究发现，MMR基因突变多发生于右半结肠癌，而且这类患者的肿瘤分化程度也较低，黏液腺癌/印戒细胞癌的比例较高。Iacopeta等[5]研究发现，MMR基因突变的结直肠癌多发生于右半结肠，多为黏液腺癌，并且发病年龄较小，其他研究也有相似结果，可见多数研究对于MMR基因突变的患者具有病理分化较差、多为黏液腺癌、好发于右半结肠等临床病理特征达成共识。本研究表明，在Ⅲ期结直肠癌中，不同部位肿瘤患者的临床特征及MMR基因突变存在差异，右半结肠癌患者肿瘤分化程度较差（黏液腺癌/印戒细胞癌）的比例高于左半结肠癌及直肠癌，而淋巴结转移数较少，出现大于3颗淋巴结转移的比例少于左半结肠癌及直肠癌。

既往研究表明，MMR基因突变多发生于右半结肠癌，较少出现淋巴结转移[6]，Gay等[7]研究发现，MMR基因缺失患者分期相对较早（DukeA/B）。本研究结果显示，不同部位的Ⅲ期结直肠癌中，其hMLHl、hMSH2及hMSH6表达缺失存在差异，hMLH1、hMSH2表达缺失在右半结肠癌中的比例明显高于左半结肠癌、直肠癌，差异有统计学意义；同时，右半结肠癌肿瘤分化差、hMLH1表达缺失比例高，可能原因是分化差的癌细胞增殖分裂加快，其基因发生错配的概率增加，导致hMLH1表达缺失率上升。

表1 不同部位Ⅲ期结直肠癌的临床病理比较

关于MMR基因突变与结直肠癌预后的关系备受关注。Dietmaier[8]分析提示，MMR缺陷患者总生存较MMR正常的患者明显延长，是预后预测因素，而Vlaykova等[9]认为，MMR缺陷的SCRC患者OS较MMR正常的患者无明显差异，MMR对于结直肠癌患者选择合适的治疗方案具有指导意义，大量临床试验发现MMR或MSI的肿瘤对常用化疗药如5-Fu、DDP等耐药，因此近年来对于Ⅱ期结直肠癌患者推荐进行MSI或MMR基因突变的检测，如果存在hMLHl及hMSH2缺失或MSI-H肿瘤，不建议这部分患者使用5-FU类药物单药进行术后辅助化疗。MMR在SCRC中具有相对特殊的临床病理，在出现淋巴结转移的Ⅲ期结直肠癌中是否具有预测预后的价值，有待进一步研究。

[1]陈琼,刘志才,程兰平,等.2003-2007年中国结直肠癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤,2012,21(03):179-182.

[2]陈万源,范永田,刘勇,等.浙江省肿瘤医院近20年结直肠癌临床特征变化分析[J].中国肿瘤,2014,23(7):563-566.

[3]Shia J,Stadler Z K,Weiser M R,et,al.Mismatch repair deficient-crypts in non-neoplastic colonic mucosa in Lynch syndrome:insights from an illustrative case[J].Fam Cancer,2015,14 (1):61-68.

[4]Kim H R,Kim H C,Yun H R,et al.An alternative pathway in colorectal careinogenesis based on the mismatch repair system and p53 expression in Korean patients with sporadic colorectal cancer[J]. Ann Surg Oncol,2013,20(12):4031-4040.

[5]Iacopetta B,Grieu F,Amanuel B.Microsatellite instability in colorectalcancer[J].Asia Pac J Clin Oncol,2010,6(4):260-269.

[6]Kaur G,Masoud A,Raihan N,et al.Mismatch repair genes expression defects&association with clinicopathologicalcharacteristics in colorectalcarcinoma[J].Indian J Med Res,2011,134(2):186-192.

[7]Gay L J,Arends M J,Mitrou P N,et al.MLH1 promoter methylation,diet,and lifestyle factors in mismatch repair deficient colorectal cancer patients from EPIC-Norfolk[J].Nutr Cancer,2011,63 (7):1000-1010.

[8]Dietmaier W.Microsatellite instability.A new predictive marker?[J]. Pathologe,2010,31(Suppl2):268-273.

[9]Vlaykova T,Mitkova A,Stancheva G.Microsatellite instability and promoter hypermethylation of MLH1 and MSH2 in patients with sporadic colorectalcancer[J].J BUON,2011,16(2):265-273.

Clinicopathological and molecular features of stageⅢ colorectal cancer at different sites

CHEN Wanyuan,JU Haixing,WU Wei,et al.Department of Colorectal Surgery，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022,China

【 Abstract】 Objective To examine the clinicopathological and molecular features of colorectal cancer at different sites. Methods The clinicopathological data of 340 cases of stage III colorectal cancer were collected.The expressions of hMLHl, hMSH2 and hMSH6 protein were examined with EnVision immunohistochemistry,and the clinicopathological and molecular features of colorectal cancer at different sites were assessed with univariate analysis. Results There were significant differences in tumor invasive depth and differentiation among right-sided colon,left-sided colon and rectal cancers.There were no significant differences in age,gender and lymph node metastasis among tumors at different sites(P＞0.05).The lost expression rate of hMLH1 in right-sided colon,left-sided colon and rectal cancers was 13.4%,2.9%and 5.7%,respectively(P＜0.05);that of hMSH2 was 6.7%,1.5%and 4.7%,respectively(P＜0.05);that of hMSH6 was 3.3%,2.9%and 1.9%,respectively (P＞0.05);while that of MMR (hMLH1+hMSH2+hMSH6)was 23.3%,7.4%and 11.8%,respectively(P＜0.05). Conclusion There are significant differences in clinicopathological and molecular features among stageⅢcolorectal cancers at right colon, left colon and rectum.

Colorectalcarcinoma Mismatch repairgene Immunohistochemistry

2015-11-09）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省自然科学基金（Y207427）；钱江人才计划（2013R 10079）

310022 杭州，浙江省肿瘤医院结直肠外科（陈万源、鞠海星、李德川），病理科（吴伟、胡锦林）

鞠海星，E-mail：juhaixing@126.com