银杏叶提取物与华法令协同抗凝影响的研究

唐志苗 倪一鸣

银杏叶提取物与华法令协同抗凝影响的研究

唐志苗 倪一鸣

目的 通过观察银杏叶提取物注射液（Egb761）对抗凝家兔PLT、PT、APTT、血小板凝血功能的作用，探讨Egb761对华法令抗凝的影响。方法 48只家兔随机分成两大组，第1大组服华法令抗凝，使PT达到正常值的1.5～2.5倍（国际标准化比值为1.8～3.7），第2大组服华法令抗凝使PT达到正常值的2.5～3.5倍（国际标准化比值为3.7～6.0），每大组又分成对照组（耳缘静脉注射0.9%氯化钠注射液0.3ml/kg），小剂量组（耳缘静脉注射银杏叶提取物注射液0.3ml/kg），中剂量组（耳缘静脉注射银杏叶提取物注射液1.5ml/kg）和大剂量组（耳缘静脉注射银杏叶提取物注射液3.0ml/kg），每组6只（雌雄对半），连续给药7d，于给药的第7天静脉注射金纳多，1.5h后自耳缘动脉采血5ml,进行PLT、PT、APTT、血小板3因子有效性（PF3aT）等检测。结果 Egb761对抗凝家兔的PT、APTT、PLT均无影响（均P＞0.05），但影响血小板3因子（PF3），使PF3aT的第3管较第4管延长（P＜0.05），且长INR实验组的影响明显大于短INR组。结论 Egb761通过影响血小板活化，进而影响PF3，使机体凝血功能缺陷，并与华法令产生协同作用,使机体凝血功能缺陷更明显，结果使机体处于易出血状态，从而影响华法令抗凝治疗。

银杏叶提取物注射液 家兔 华法令 抗凝治疗

银杏叶提取物（Egb761）在临床上已广泛应用，但有报道Egb761本身或与华法令联用有增加出血的危险[1]。本课题组前期研究表明：Egb761通过影响血小板第3因子（PF3），使机体凝血功能缺陷（处于易出血状态），对凝血功能产生影响，从而可能影响华法令抗凝治疗。笔者观察银杏叶与华法令合用是否会对其抗凝产生协同作用。

1 资料和方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔，雌雄各半，体重1.9～2.1（2.16±0.13）kg，购于金华市药检所，合格证号：SYCXK（浙）2006-0024。

1.2 药品和仪器 银杏叶提取物注射液（金纳多）为5ml/支，含银杏叶提取物17.5mg，其中含银杏黄酮4.2mg，德国威码舒培博士药厂生产；华法令钠片：3.0mg/片，芬兰Orion Corporation公司提供。PT、APTT试剂（意大利IL公司生产）；40g/L白陶土悬液（以9g/L氯化钠溶液作为溶剂），0.025mol/L氯化钙溶液。XE-2100全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司生产）及原装配套试剂；广州阳普医疗用品有限公司提供的血凝试管（109mmol/L柠檬酸钠1∶9）；AL-9000全自动血凝分析仪（Instrumentation Laboratory）意大利IL公司生产；水浴恒温箱；秒表；分析天平。

1.3 方法

1.3.1 兔的饲养 整个实验过程，兔由专业饲养人员同一批全价营养颗粒饲料进行喂养，并保持饲养及实验场所温度17～25℃，相对湿度40%～70%。抗凝模型的建立：对需抗凝的第1、2组兔子，根据人类换瓣术后抗凝的华法令剂量折算后按体重灌服，并每日监测国际标准化比值（INR），使INR相对稳定，并达到正常值的1.8～3.7（第1组）或3.7～6.0（第2组）。

1.3.2 实验分组和干预措施 新西兰大白兔48只，实验分两组段进行。每组24只，随机又分为4小组，分别为对照组及大、中、小剂量组，每小组各6只，雌雄各半。第1组喂服华法令抗凝，使INR达到正常值的1.8～3.7，第2组服华法令抗凝使INR达到正常值的3.7～6.0。分别为各组动物先耳缘静脉注射给药。Egb761小、中、大剂量组分别注射银杏叶提取物注射液（0.3、1.5、3.0ml/ kg，约相当于人的剂量的1、5、10倍）[2]；对照组注射0.9%氯化钠注射液（0.3ml/kg），连续给药7d，于给药第7天静脉注射银杏叶提取物注射液后1.5h自耳缘动脉采血5ml，进行PLT、PT、APTT、血小板第3因子有效性试验（PF3aT）等检测。

1.3.3 标本处理和检测 用真空采集法从兔耳缘动脉直接采血至专用血凝试管和血常规试管各1份。PT、APTT按操作规程在AL-9000全自动血凝分析仪上检测。PLT按操作规程在XE-2100全自动血液分析仪上检测。PF3aT测定严格按《全国临床检验操作规程》进行[3]。（1）富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）的制备。自清醒新西兰大白兔耳缘动脉真空取血，以109mmol/L柠檬酸钠1∶9抗凝收集于血凝试管中的血，于室温经1 800r/min离心10min，所得血浆即为PRP；剩余血液再以4 000r/min离心10min，上层液即为PPP，作为测定时调零或用于调整PRP中的血小板数及实验过程中，PRP中的血小板数调整至约500×109/L。（2）PF3aT测定注意事项。真空采血顺利并立即分离血浆；PRP中血小板调至（540±20）×109/L，PPP中血小板调至（10～20）×109/L，避免红细胞混入；标本测定前所用的器材均为凝血专用器材，测定时的试管用洁净玻璃试管；40g/L白陶土悬液使用前充分混匀，白陶土加入标本后，标本在孵育期也混匀数次；每1组测定2次，取平均值。（3）PF3aT测定步骤。取4支小试管分4组，按表1每管加入PRP和PPP各0.1ml。将上述4支试管置37℃水浴预温2min后从第1管起依次每隔2min加0.2ml白陶土悬液。记录加入白陶土的时间，20min后一次加入0.2ml浓度为0.025mmol/L的氯化钙溶液，同时启动秒表测定凝固时间。（4）PF3aT测定结果判断。第3管、第4管分别为待测者和正常对照管,第1管较第2管凝固时间延长5s以上为异常，见于PF3a减低；PF3a有缺陷或内源凝血因子有缺陷时第3管凝固时间比第4管长。

表1 PF3aT测定（ml）

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PT、APTT、PLT变化比较 见表2。

表2 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PT、APTT、PLT变化比较

由表2可见，抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后各组间PT、APTT、PLT变化比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PF3aT值变化比较 见表3。

由表3可见小、中、大剂量组静脉注射Egb761后PF3aT值第1管凝固时间均大于第2管（均P＜0.05），第4管凝固时间均少于第3管（均P＜0.01）。但不同剂量间组差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PF3aT值不同管间差值比较 见表4。

表3 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PF3aT值变化比较

表4 抗凝家兔（INR为1.8）静脉注射Egb761后PF3aT值不同管间差值比较

由表4可见，两组间第3管与第4管差值差异有统计学意义（P＜0.01），第1管与第2管差值差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PT、APTT、PLT变化比较 见表5。

表5 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PT、APTT、PLT变化比较

由表5可见，抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PT、APTT、PLT变化组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PF3aT值变化比较 见表6。

表6 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PF3aT值变化比较

由表6可见，小、中、大剂量组第3管凝固时间均比第4管延长（均P＜0.05）；第1管凝固时间均比第2管延长（均P＜0.01）。但不同剂量组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PF3aT的值不同管间差值比较 见表7。

表7 抗凝家兔（INR为3.7）静脉注射Egb761后PF3aT的值不同管间差值比较

由表7可见，两组间第3管与第4管差值，差异有统计学意义（P＜0.05）；组第1管与第2管差值差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

银杏叶提取物，即Egb761已广泛应用于临床。而今华法令作为抗凝药也是广泛应用于心血管病患者。人工瓣膜置换术、血管移植术后患者为防治血栓形成常规应用华法令，此外也经常应用于心房颤动患者，因华法令对心房颤动患者缺血性中风有预防作用，它可使心房颤动患者每年发生缺血性中风的危险性下降60%[4]。但近年来不断有银杏叶提取物引起出血的报道[5]，并建议患有心脏病、脑梗死、各种血栓症并且在服用华法令等抗血小板药的时候，应尽量避免同时使用银杏叶提取物[6]。本课题组前期研究已表明[7]：大、中、小剂量组Egb761对PLT、PT、APTT均无影响。但Egb761对PF3aT有影响（第3管值大于第4管，即正常值），但不同剂量Egb761对PF3aT影响无差异，提示Egb761能使机体处于凝血功能缺陷状态，有增加出血倾向的危险，从而影响华法令的抗凝治疗，但Egb761与华法令联用是否会对其抗凝产生协同作用，有待进一步研究。因此，笔者采用动物实验的方法观察Egb761与华法令协同对抗凝的影响。

本研究结果表明Egb761对华法令抗凝治疗的家兔PF3aT有影响（增强华法令的抗凝作用）：INR为1.8及3.7时，大、中、小剂量组Egb761均对喂服华法令抗凝家兔的PLT、PT、APTT无影响,但Egb761对PF3aT有影响（第3管值大于第4管，即正常值），且随INR值增大，对PF3aT影响更明显（第3管值与正常值的差值更大），提示机体凝血功能缺陷更明显。

华法令作用机制为在肝细胞上与维生素K竞争结合部位，抑制维生素K依赖因子羟基化，使这些凝血因子（Ⅱ、Ⅹ等）不能与磷脂表面结合，参与凝血过程的作用，结果使INR值增大。Egb761与华法令共同应用时，一方面Egb761可通过影响血小板功能活化而使PF3减少，进而使为凝血提供催化所需磷脂表面的有效面积减少，吸附并激活的凝血因子（Ⅱ、Ⅹ等）的能力相应减小；另一方面华法令通过抑制维生素K依赖因子羟基化，使能够与磷脂表面结合的凝血因子Ⅱ、Ⅹ等数量减少，从而使两者发生相互协同作用，结果使机体血液凝固进一步减慢，导致凝血功能缺陷更明显，机体处于更易出血状态。而且INR值增大，能与磷脂表面结合的凝血因子Ⅱ、Ⅹ等数量越少，故对PF3aT影响更明显（第3管值与正常值的差值更大），提示机体凝血功能缺陷更明显。

另外，Egb761与华法令均有抗血小板凝聚功能[8]，这也使比两者单独使用可能更容易出血。

以上实验表明：Egb761通过影响PF3（使机体凝血功能缺陷）和血小板聚集功能，与华法令产生协同作用，使机体处于易出血状态，从而影响华法令抗凝治疗。

本组实验中未发现所实验家兔明显出血，可能是实验过程还不够长，或者银杏叶引起的出血概率相对不大，不能从这组动物中体现出来。但出血并发症对抗凝患者是严重的安全问题，故华法令抗凝患者应注意这个问题，以免出现出血并发症。

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Effect of ginkgo bibola leaves extract on coagulation status in rabbits with anticoagulant

TANG Zhimiao,NI Yiming.Department of Thoracic Surgery,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effect ofextract ofginkgo bibola leaves(Egb)on coagulation status in rabbits with anticoagulant. Methods Forty eight rabbits were divided randomly into two groups(n=24 in each group).Warfarin was given in group 1 to achieve 1.8～3.7 times INR of normal rabbits;and given in group 2 to achieve3.7～6.0 times INR.Each group was further divided into 4 subgroups with 6 animals in each,including three Egb groups and one control group.Intravenous infusion of 0.3ml/kg NS was given to the rabbits in control group,and 0.3ml/kg,1.5ml/kg,3ml/kg Egb761 were given to the rabbits in three Egb groups for 7 days,respectively.After 1.5 h of injection on d7,the blood samples were collected,and PLT,PT,APTT,PF3aT were examined.Results Egb761 had no effect on PLT,PT,APTTofanticoagulant rabbits(P＞0.05);while it affected PF3aT levels (P＜0.05),the effect was more marked in group 1 than that in group 2.Conclusion Injection of ginkgo bibola leaves extracts may affect anticoagulation therapy ofwarfarin in rabbits.

Injection ofginkgo bibola leaves extractRabbitWarfarin Anticoagulation therapy

2015-12-21）

（本文编辑：田云鹏）

321000 金华市中心医院心胸外科（唐志苗）；浙江大学医学院附属第一医院心胸外科（倪一鸣）

唐志苗，E-mail：tangzhimiao@163.com