反枝苋内生菌筛选及其铬富集效果研究

李方圆，张超兰*,黄 河，张静静，卢美献，李传章

(1.广西大学环境学院，广西 南宁 530004；2.广西壮族自治区环境监测中心站，广西 南宁 530028)



反枝苋内生菌筛选及其铬富集效果研究

李方圆1，张超兰1*,黄 河1，张静静1，卢美献1，李传章2

(1.广西大学环境学院，广西 南宁 530004；2.广西壮族自治区环境监测中心站，广西 南宁 530028)

以分泌吲哚乙酸(IAA)、铁载体能力以及对重金属离子耐受性为筛选指标，从反枝苋(AmaranthusretroflexusL.)根系中筛选出分泌IAA、铁载体和耐铬能力强的两株菌株G3和G8，通过盆栽实验研究分析了其对反枝苋累积铬的影响，根据形态特性和16S rDNA序列分析对供试菌株进行分类鉴定。结果显示，菌株G8分泌IAA能力达到17.80 mg·L-1，强于其他菌株；菌株G3、G8对铬、镉、铅离子的耐受性分别为200、20、300和100、20、400 mg·L-1。盆栽实验中，接种菌株G8处理后反枝苋地下部生物量和重金属累积量与对照相比显著提高，并增强了地下部对铬的富集能力。通过进行16S rDNA序列分析，菌株G3与Pseudomonassp.CZGSD7的序列相似性达到99 %；菌株G8与PseudomonasextremorientalisCNU082017的序列相似性达到100 %，2株菌株初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。

内生菌；超富集植物；重金属铬；反枝苋；植物修复

近年来植物修复技术因其经济、绿色、环境友好，且不引入二次污染等优点逐渐进入我们的视野[1-3]。通过超富集植物吸收重金属并将其转移到地上部，从而降低重金属在土壤中的含量和有效态含量[4]。铬化合物是金属加工、冶金、制革、电镀、颜料等行业所用的基本原料，以多种途径进入生态圈，使得铬污染威胁着人类与动植物的生存环境[5]。大多数植物对铬的耐受能力低，根系的生长发育受其抑制[6]，Rout[7]等人发现在含铬浓度为200 μM胁迫下光头稗子(Echinochloacolona)的发育率降低了25 %；与Cd、Pb相比较下，Cr对蒿柳(Salixviminalis)根部生长抑制最为严重[8]；一些耐性植物生长慢、生物量小、对重金属有选择性、周期长等[9]，也一定程度上制约了植物修复技术的发展。

植物修复的关键在于超富集植物能否将土壤中的重金属提取出与生物量，并有效地由地下部向地上部转移。Kleopper提出了植物促生细菌的概念，包括了对植物有益，以及具有促生能力的细菌。研究发现，微生物可促进植物的生长、提高植物对重金属富集的能力[10-11]，其作用在植物内部及根系周围，通过分泌植物生长激素如吲哚乙酸(IAA)、合成1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACCD)、固氮、溶解无机磷酸盐的能力，促进宿主植物生长发育[12]。因此，利用具有对重金属耐受性的促生细菌改善植物的营养状况，提高植物富集效率，为植物修复重金属污染土壤开辟了新思路。

反枝苋(AmaranthusretroflexusL.)，系苋科苋属的一年生草本植物，广布在我国东北、华北地区，多生长在农田边。植物对环境的适应能力极强，且具有生长快生物量大等特点，但通常被农户视为杂草处理，未引起人们重视。在广西宾阳某制革厂的污泥池中，发现了长势良好的植株反枝苋，并采样拿回实验室进行了重金属含量的分析测定，发现其对重金属铬的富集情况可观，可作为修复铬污染土壤的潜在优势植物加以利用。郑施雯等[13]在温州某制革区进行了土壤采样和植物调查也发现，植物反枝苋为耐Cr的优势植物，在Cr浓度为3844 mg·kg-1的污染土壤中，反枝苋的地下部Cr的富集能力达到932.67 mg·kg-1，地上部达到181.70 mg·kg-1，可作为生态修复铬污染土壤的先锋植物，而国内外对反枝苋富集铬的效果研究还鲜有报道。本研究从植物反枝苋根系中分离出内生菌，以分泌IAA、铁载体及Cr耐受性为主要筛选指标，筛选出植物内生菌，联合反枝苋进行盆栽实验，探讨耐铬内生菌对反枝苋的生长及对铬的富集能力的影响，旨在为内生菌联合反枝苋修复Cr污染土壤提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物样品：反枝苋采自广西南宁宾阳县某制革厂制革污泥池，采集的植物放入密封袋中在4 ℃保藏，并尽快对其根系内生细菌进行分离筛选。供试植物：反枝苋种子采自广西南宁宾阳县某制革厂制革污泥池。供试土壤：采自广西宾阳县某制革厂周边的水稻土，制革厂污泥池中渗滤液未能妥善处理，常年流入灌溉沟渠，其中掺杂的大量重金属Cr也因此流入水稻田中。土壤的基本理化性质：pH 7.66，有机质 41.5 g·kg-1，CEC 10.8 cmol·kg-1，碱解氮 178.94 mg·kg-1，有效磷 11.1 mg·kg-1，总Cr 2534.68 mg·kg-1。

1.2 实验方法

1.2.1 耐铬内生菌的分离纯化 铬抗性细菌筛选固体培养基：参考孙乐妮等[14]的方法配制1/5 LB培养基，在1/5 LB培养基上添加CrCl3·6H2O母液，分别配置成含Cr3+浓度为30、60 mg·L-1固体培养基。用清水清洗干净反枝苋的根系，再用70 %的酒精浸泡消毒5 min后，用无菌水清洗五次，用6 %的次氯酸钠浸泡15 min，无菌水清洗5次。在无菌超净台中，取1 g表面消毒后的根系于无菌研钵研磨捣碎，原液逐级稀释后涂布在含Cr3+浓度为30 mg·L-1铬抗性细菌筛选固体培养基上，随机挑选不同形态、生长良好单菌落反复纯化后，将各单一菌落转接至含Cr3+浓度为60 mg·L-1铬抗性细菌筛选固体培养基，挑选出生长良好的耐铬菌株转接至斜面，4 ℃保藏备用。

1.2.2 耐铬菌株促生特性分析 在含Cr3+浓度为60 mg·L-1的抗性平板上，根据菌落颜色、形态、大小等特征初步分离得到35株细菌，进而通过分析35株细菌产IAA、产铁载体能力来评价其促生特性。产IAA内生菌定性与定量筛选方法参照sheng[15-16]等的方法；产铁载体能力测定参考王平[17-18]等的方法。

1.2.3 菌株对重金属耐受特性分析 通过最小抑制浓度来确定供试菌株对重金属离子的抗性。将平板培养24 h的菌株接种在含有一定重金属离子浓度的1/5 LB培养基中，置于30 ℃、150 r·min-1摇床中培养2～6 d。Cr3+(CrCl3·6H2O)浓度设为50、100、150、200、250、300 mg·L-1；Cd2+(CdCl2·H2O)浓度为10、20、30、40、50、60 mg·L-1；Pb2+(PbCl2)浓度设为100、200、300、400、500 mg·L-1。在分光光度计下测定600 nm处吸光值OD600，吸光值与该浓度下未接菌培养液的吸光值无明显差异即为重金属离子最小抑制浓度。

1.2.4 耐铬菌株对反枝苋累积铬的影响 将反枝苋种子用70 %的酒精浸泡消毒5 min，无菌去离子水清洗。再用2.5 %次氯酸钠中浸泡20 min。用无菌去离子水漂洗5次，完成种子表面消毒。取高温灭菌后蛭石平铺在育苗盘上，种子表面消毒后均匀播入盘中，并覆盖上蛭石约10 mm，每天浇灌适当的无菌霍格兰营养液保持蛭石湿润，置于光照培养箱中培养，生长约3周后，选取长出4片真叶、长势一致的幼苗待用。供试土壤自然风干后，过10目筛混匀，取1 kg装入花盆中。选取长出4片真叶、长势一致的幼苗，将其根部分别放入等量的OD600=1.0的G3、G8菌悬液浸泡4 h，并以无菌水为空白对照，移栽至供试土壤中，分别记为：CK(浸于无菌水)；G3(浸于G3菌悬液)；G8(浸于G8菌悬液)。每盆定植1株，各处理设置4个重复，定期施入复合肥，放置于广西大学环境学院人工气候室内，每天浇灌100 mL去离子水。40 d后收获，测量植株地下部、地上部生物量，地下部用自来水清洗后，用20 mmol·L-1EDTA溶液交换15 min去除根部吸附离子，再用去离子水漂洗2～3次。将洗干净的地上部和地下部烘干过筛，微波消解后，用ICP-AES测定总Cr含量。

1.2.5 菌株16S rDNA基因同源性分析 将筛选出来的耐铬菌株G3和G8接种于斜面固体培养基保藏，测序相关工作交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。菌株基因组DNA提取采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取；PCR扩增采用通用引物7F(5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3＇)和1540R(5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇)进行16S rDNA的PCR扩增；取回PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳后回收，PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，PCR产物用PCR引物直接测序。将所得的序列与GenBank数据库中的核酸数据库进行BLAST分析比对，选取同源性较高的菌株与供试菌株序列相似性分析，通过Mega6.06软件以邻接法(Neighbour-Joining)构建系统发育树，以确定该菌株的分类地位。

1.3 数据分析

用Microsoft Excel 2010和Origin 8.5处理数据和作图，数据之间的显著差异用SPSS 19.0软件进行ANOVA方差分析和多重比较(LSD，P≤0.05)。转移系数计算是植物地上部重金属的富集量与植物地下部重金属富集量的比值；生物富集系数为植物体内重金属含量与土壤重金属含量之间的比值。

图1 菌株产IAA的定量分析Fig.1 Quantitative determination of IAA-producing of strains

2 结果与分析

2.1 耐铬菌株促生菌的特性

2.1.1 耐铬菌株产IAA能力评价 吲哚乙酸是一种重要的植物生长激素，在较低浓度下即能促进细胞的伸长生长。根际的微生物分泌植物生长激素，促进根细胞的分裂和生长，通过生长激素调节细胞代谢活动，从而缓解重金属的危害[19]。结果显示，在35株耐Cr菌株中，有15株具有产IAA的能力，占供试菌株的42.9 %。对具有产IAA能力的15株菌株进行定量测定，结果如图1所示，分泌量在5.00 mg·L-1以上的有5株，占供试菌株的14.3 %，其中G8菌株产IAA能力最强，达到17.80 mg·L-1，分泌量最少的是菌株G12，G9、G14和G15也较少。

2.1.2 耐铬菌株产铁载体特性评价 从表1看出，A/Ar(A和Ar分别为接菌和未接菌上清反应液在630 nm波长处的吸光值，从0～1.0之间以0.2为间隔，每减小0.2增加一个+)比值越小，反映的产铁载体能力越强，产铁载体能力强的菌株G1、G2、G3和G9共4株，占耐铬菌株中的11.4 %，G5、G6、G8、G10、G13有着较好的产铁载体能力，G4、G11、G12、G14和G15产铁载体能力极低。

表1 供试菌株产铁载体能力

表2 菌株对重金属耐受性

注：+表示菌株生长；-表示菌株不生长。

Note：‘+’means grow; ‘-’means not grow.

2.2 供试菌株对重金属的耐受性

细菌在重金属胁迫下能发挥其自身的促生作用，还需对重金属有较高的耐受性，以保证细菌在高浓度下自身的良好生长，本研究在之前的实验基础上，挑选出了2株产铁载体能力强的菌株G1、G3，分泌IAA能力高的菌株G8，以及铁载体能力弱的菌株G14、G15进行重金属耐受性实验。结果见表2，供试菌株对Cr、Cd、Pb等3种重金属离子有不同的耐受性，G1、G3菌株对Cr3+有很高的耐受性，最小抑制浓度达到了200 mg·L-1，G8和G15次之，而菌株G14耐受性仅为50 mg·L-1；在5株供试菌株中，菌株G15对Cd2+有着较强的耐受性，达40 mg·L-1，菌株G1、G3、G8、和G14对Cd2+的耐受性均未超过20 mg·L-1；Pb2+耐受性方面，仅菌株G15有着较低的耐受性，为200 mg·L-1，其他供试菌株均有良好的耐受性，对Pb2+的最小抑制浓度高达300 mg·L-1及以上。

2.3 菌株对反枝苋生长及累积Cr的影响

2.3.1 不同处理对反枝苋植株生物量的影响 内生菌对反枝苋浸根处理后生物量表现不一(图2)。与对照相比，内生菌G3处理后反枝苋的地上部、地下部生物量未见显著提高，G3处理后地上部生物量仅提高了0.38 g。内生菌G8浸根处理后，反枝苋生物量得到较大提高，地上部较对照提高了54.1 %，达显著性差异，地下部与对照相比显著提高了71.3 %，表明内生菌G8浸根处理后促进反枝苋的生长发育。

相同字母表示不同处理之间差异不显著(P<0.05)Values followed by the same letters are not significantly different at P<0.05图2 不同菌株对反枝苋生物量的影响Fig.2 Effects of biomass of A.retroflexus with different stains

2.3.2 不同菌株处理对反枝苋Cr累积量的影响 如表3所示，反枝苋地上部、地下部对铬的富集量均超过了超富集植物含量的参考值1000 mg·kg-1[20]，但地上部铬的含量低于地下部，即转移系数小于1，说明反枝苋对Cr的富集主要集中在根部。反枝苋地下部和地上部对铬均有较强的富集能力，并且反枝苋植物对重金属铬具有很强的耐性。内生菌G8处理后，反枝苋地下部对铬的富集量显著高于对照，较对照提高了9.2 %，对铬的累积量较空白对照提高了69.5 %。G3处理的反枝苋地下部和地上部对铬的富集量无明显差异。对整株植物而言，菌株G8处理后反枝苋对铬的生物富集系数显著高于对照和G3处理，表明G8处理提高了植物体对铬累积量，使植物表现出较强的富集能力。从转移系数看，G3、G8与对照的转运系数均无显著差异。

2.4 供试菌株分子生物学鉴定

经平板划线、革兰氏染色，观察菌株培养特征及形态特征，可见G3菌株菌落较大，浅橙色，隆起，边缘整齐，表明光化，较湿润，较透明，为革兰氏阳性菌；G8菌落较小，乳白色，隆起，边缘整齐，表面光滑，较湿润，不透明，革兰氏阳性菌。菌株的基因测序结果片段长度分别为1403和1419 bp，通过NCBI Blast序列比对发现两株菌株均属于假单胞菌属(Pseudomonas)，与该属其他物种的16s rRNA序列比较，构建系统发育树(图3)并进行序列相似性分析，菌株G3与Pseudomonassp.CZGSD7的序列相似性达到99 %；菌株G8与PseudomonasextremorientalisCNU082017的序列相似性达到100 %，因此初步鉴定菌株G3、G8均为假单胞菌属。

表3 不同菌株处理对反枝苋Cr含量和累积量的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同小字字母表示5 %的差异显著性(P<0.05)。

Note：Reasults in the table are means±SD; Values in the same column followed by differennt letters are significantly different atP<0.05.

3 讨 论

内生细菌与植物长期共存，已成为植物微生态系统的组成部分，植物为许多的内生细菌提供了复杂的微环境、生长所需的营养元素和生长条件，形成互利的共生关系，但内生菌能否有效生存和定殖，还取决于自身固有的生理特征及植物根围生物和非生物性的因素[21-22]。在重金属污染环境下，菌株对重金属的耐受性，是筛选能修复重金属土壤、具有联合超富集作用的植物内生菌的首要指标。本研究中，从铬富集植物反枝苋根系中分离得到了35株耐铬菌株，其中内生菌G1、G3对Cr3+有良好的耐受性，可耐受Cr3+浓度达到200 mg·L-1，G1对Pb2+的耐受性也较为突出，G15对Cd2+具有较高的耐受性。菌株G8对Cr3+也具有一定的耐受能力。这与Khan等[23]在牧豆树(Prosopisjuliflora)的根系、茎和根际土中分离得到26株细菌，其中4株对铜、镉、铅、锌有不同程度的耐受性，提高黑麦草富集制革废水污染土壤中的铬的研究结果具有一定相似性。

本研究中，接种与未接种高产IAA的内生菌G8

图3 菌株G3、G8与相关菌株的16S rRNA基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of strain G3,G8 and relevant strains

相比较差异显著，证明了分泌IAA的菌株处理可有效地提高反枝苋的生物量。这与Patten[24]等人研究结果相似。表明菌株的产IAA能力对作物根系的生长起着重要作用。实验还发现，内生菌G8浸根处理后，不仅促进了反枝苋地下部对铬的富集能力，还提高了反枝苋的生物量，进而提高了修复效率。可能内生菌G8的存在缓解了重金属的毒害，并持续释放IAA，促进植物生长，增加植物生物量，从而提高了反枝苋富集铬的效率。这与Sheng等[15]将菌株PseudomonasfluorescensG10对油菜进行灌根处理使得油菜的生物量与增加的结果相类似。即使高浓度的重金属抑制下，内生菌亦能通过合成分泌IAA来促进植物的生长。我们还将分泌IAA能力较低、分泌铁载体能力强的菌株G3接种到反枝苋根系，结果发现，菌株G3对反枝苋浸根处理后虽然提高了植株的生物量，但提高效果不显著。反枝苋无论是在25 ℃以上，还是在较低温度(15 ℃)和较低光照条件下，都可以保持很高的光合能力[25]，这也为反枝苋应用于野外修复铬污染土壤提供了可能。从反枝苋根部筛选出的假单胞菌属G8，具有分泌IAA、铁载体的能力等促生特性，根部接种G8后，显著提高了地下部铬的含量和总的累积量。这可能由于内生菌G8分泌的植物激素IAA，促进了根部的生长和发育，以致其更好地吸收营养和水分，间接地改善了反枝苋根部的营养状况[26-27]。可见，菌株分泌IAA是促进反枝苋生物量提高、生长抑制影响减弱的主要因素。

4 结 论

从铬富集植物反枝苋根系筛选出的内生菌G3和G8对铬、镉、铅离子的耐受性分别为200、20、300和100、20、400 mg·L-1。其中菌株G8具有较强的产IAA功能，分泌能力为17.80 mg·L-1。接种菌株G8处理后反枝苋地下部生物量和重金属累积量显著提高，并增强了地下部对铬的富集能力。通过进行16S rDNA序列分析，两株菌株初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。可见，菌株G8联合反枝苋修复铬污染土壤具有良好的应用前景。

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(责任编辑 温国泉)

Screening of Plant Growth-promoting Endophytic Bacteria fromAmaranthusretroflexusL. and Their Effects on Chromium Accumulation in Plant

LI Fang-yuan1, ZHANG Chao-lan1*, HUANG He1,ZHANG Jing-jing1, LU Mei-xian1, LI Chuan-zhang2

(1.College of Environment, Guangxi University, Guangxi Nanning 530004, China;2.Guangxi Environmental Monitoring Center，Guangxi Nanning 530028, China)

The study isolated the chromium-resistant plant growth-promoting bacteria(PGPB) that producing indole-3-acetic acid(IAA), siderophores fromAmaranthusretroflexusL. Two enhanced chromium(Cr)-resistant strains, named as G3 and G8, were isolated from the root which both have abilities to producing IAA and siderophores.According to the morphological characteristics and 16 s rDNA,Pot experiments were conducted to investigate their effects on promoting the growth and Cr accumulation inA.retroflexusL. The result showed that strains G8 utilized tryptophan as a precursor for IAA synthesis was 17.80 mg·L-1and IAA production capacity was better than rest of other strains. The minimal inhibitory concentration of chromium, cadmium, lead for the strains G3 and G8 were 200, 20, 300 and 100, 20, 400 mg·L-1, respectively. The root (up to 71.3 %) biomass and accumulation of heavy metal increased significantly (P< 0.05) after inoculation with strain G8 compared to the uninoculated control. In addition, the strain G8 significantly increased the Cr concentration in the root ofA.retroflexusL. The endophytic bacterial strain G3 and G8 were identified asPseudomonassp.(99 % similarity) andP.extremorientalis(100 % similarity) respectively,based on the 16S rDNA gene sequence analysis.

Endophytic bacteria; Hyperaccumulator; Chromium(Cr);AmaranthusretroflexusL.; Phytoremediation

1001-4829(2016)07-1694-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.035

2016-03-02

广西自然科学基金项目(2014GXNSFAA118039，2015GXNSFEA139001)；广西科学研究与技术开发计划项目(2014DD29046)

李方圆(1990-)，男，广西南宁人，硕士，研究方向为土壤污染修复与治理，*为通讯作者， E-mail： zhangcl@gxu.edu.cn。

S567.219

A