金属还原酶FreB2对烟曲霉铁吸收及氧化压力应答的影响

王伟伟 ， 吴翠娇*， 赵 巍， 张姗姗， 王 斌

(1.青岛大学医学院 组织学与胚胎学教研室，山东 青岛 266071；2.青岛大学医学院 微生物学教研室，山东 青岛 266071)



金属还原酶FreB2对烟曲霉铁吸收及氧化压力应答的影响

王伟伟1， 吴翠娇1*， 赵 巍2*， 张姗姗1， 王 斌2

(1.青岛大学医学院 组织学与胚胎学教研室，山东 青岛 266071；2.青岛大学医学院 微生物学教研室，山东 青岛 266071)

利用构建的烟曲霉金属还原酶基因(AFUA-1G00350，FreB2)缺失突变株，对烟曲霉金属还原酶基因FreB2功能进行初步研究，为揭示该基因与烟曲霉的致病关系提供依据。比较野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时高铁还原酶的活性，绘制不同时间野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时高铁还原酶活性曲线。利用Real-Time PCR方法分析SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB这些与铁的吸收相关基因的mRNA的表达量变化。测定野生株和基因缺失突变株对氧化压力的敏感性及胞内活性氧物质含量。不论在AMM液体培养基中还是在无铁AMM液体培养基中培养时，突变株高铁还原酶的活性都明显高于野生株高铁还原酶活性。与野生株相比培养60 h时，突变株SreA、SidA、FetC、FtrA和FreB这些与铁的吸收相关基因的表达量出现明显上调。氧化压力敏感性实验显示，基因缺失突变株对H2O2的敏感性显著增强，同时胞内活性氧物质含量明显增多。金属还原酶基因FreB2在烟曲霉铁吸收及氧化压力应答过程中发挥作用；烟曲霉与铁吸收相关基因之间存在功能互补效应。

烟曲霉；金属还原酶；Real-Time PCR；活性氧物质

烟曲霉是最常见的通过空气传播的条件致病菌[1]。铁是微生物必须的微量元素，铁离子的氧化还原特性使其能够作为许多关键酶类的辅助因子参与细胞内一系列重要的代谢过程[2-3]。铁离子浓度与烟曲霉的生长和致病性密切相关[4]。烟曲霉菌从宿主体内获得铁的能力是其致病性的重要条件[5]。在人体内，铁通常以乳铁蛋白或载铁蛋白的形式存在，且哺乳动物的免疫系统有通过限制铁的可利用率来抵抗微生物感染的机制，因此形成了天然的低铁环境[6-7]。为从宿主获得铁这种微量元素，烟曲霉形成了两种铁吸收途径，包括高亲和性铁吸收系统(RIA)和转铁载体吸收系统，这两种系统在菌体处于缺铁环境时都被诱导表达[8]。在转铁载体吸收系统中，两种转铁载体fusarinine C (FcS)和triacetylfusarinine C (TAFC)在鸟氨酸单氧酶的作用下被合成[9]。FcS和TAFC负责收集细胞外的铁离子，然后被转运蛋白转运到细胞内[10]。在RIA系统中，质膜上的金属还原酶等先将不溶性Fe3+还原为可溶性的Fe2+[11]，然后Fe2+被高亲和性转铁载体和铁氧化还原酶蛋白复合物转运到细胞内[12-13]。因此，金属还原酶还原过程是烟曲霉RIA系统摄取铁关键的第一步。目前已知在这两种铁吸收系统中起作用的基因见表1。

烟曲霉共有15种编码金属还原酶的基因，但目前对这些基因功能和结构的分析很少[14]。仅有FreB一种基因被证实在烟曲霉铁缺乏时和铁的吸收相关[11]。本研究选取金属还原酶基因AFUA-1G00350进行研究,并将其命名为FreB2。

表1 烟曲霉铁吸收相关基因

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 烟曲霉野生菌株Af293(W2)为美国辛辛纳提大学病理和实验医学系Judith C Rhodes教授惠赠；金属还原酶基因FreB2缺失突变菌株(ΔFreB2)为本实验室构建。

1.1.2 培养基 曲霉菌基础液体培养基(AspergillusMinimal Medium，AMM)，AMM固体平板，YG培养基的配制见文献[15]。无铁AMM除不加铁盐外与AMM培养基相同。

1.1.3 主要试剂及仪器 Bathophenanthroline disulphonate(BPS，美国Sigma公司)；PCR相关试剂(大连宝生物工程有限公司)；FermentasTaq2×Mix(MBI公司)；trizol(日本TaKaRa公司)；反转录试剂盒(北京全式金公司)；荧光定量染料(北京康为世纪公司)；二氯荧光素(DCFH-DA,美国Sigma公司)；其他试剂均为国产分析纯；酶标仪(Tecan SUNRISE，瑞士)；荧光显微镜(Olypums DP80，日本)；罗氏Lightcycler 96 qPCR仪(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fe2+浓度与吸光值标准曲线 分别向100 μL 2 mmol/L BPS溶液中加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL 浓度为1 mmol/L的FeSO4溶液，然后加入无菌双蒸水使溶液总体积达200 μL。37 ℃避光孵育1 h后于535 nm波长下测定溶液吸光值。根据不同 Fe2+浓度对应的吸光值绘制Fe2+浓度与吸光值标准曲线，得出Fe2+浓度与对应吸光值之间的函数关系。

1.2.2 金属还原酶活性测定 采用Nyhus等[16]文章中使用的方法，将W2和ΔFreB2菌株的孢子以1.0×106个/mL浓度分别接种于100 mL AMM和无铁AMM液体培养基，200 r/min、37 ℃恒温摇床震荡培养。在接种12、24、36、48、60、72 h时测量高铁还原酶活性。测量时取包含等量菌体的1 mL菌液，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，吸出500 μL上清，将剩余500 μL菌液混匀。分别向上清和菌液中加入250 μL 4 mmol/L BPS和250 μL 4 mmol/L HEDTA-Fe3+。37 ℃避光孵育1 h后在535 nm波长下测定吸光值。根据Fe2+浓度与吸光值标准曲线，得出Fe2+浓度。金属还原酶活性：(nmol Fe2+/mL/h)=(c菌液Fe2+-c上清Fe2+)/ t。

c：从Fe2+浓度与吸光值标准曲线得出的Fe2+浓度，t：加入BPS和HEDTA-Fe3+后的孵育时间。

1.2.3 Real-time PCR法检测铁吸收相关基因的表达 将W2和ΔFreB2菌株的孢子以1.0×106个/mL浓度分别接种于5 mL AMM和5 mL无铁AMM液体培养基，300 r/min、37 ℃恒温摇床震荡培养。60 h时收集并干燥菌体，采用液氮研磨法破碎菌体后加trizol提取总RNA。总RNA用反转录试剂盒转录为cDNA，再以cDNA为模版扩增。扩增引物均由上海生工生物工程有限公司设计和合成。内参为GAPDH，内参引物为上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2。反应参数：95 ℃预变性1 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共40个循环。以双ΔCt法计算各组基因与内参的比值。

表2 本研究所用引物

1.2.4 氧化压力敏感性测定 采用5倍稀释法用无菌双蒸水依次将W2和ΔFreB2菌株的孢子浓度调整为4×105、8×104、1.6×104、3.2×103、6.4×102个/μL。分别向以上5个浓度的W2和ΔFreB2菌株孢子悬液中加入等体积H2O2，使H2O2终浓度分别为100、200、300、400、500 mmol/L，对照组将H2O2改为等体积PBS, 30 ℃孵育30 min。取5 μL处理后的各浓度W2和ΔFreB2菌株孢子悬液进行点板实验，点板所用培养基为AMM固体培养基。待点板菌液完全渗透后将各平板于37 ℃恒温培养箱倒置培养48～72 h，观察各菌株生长情况。

1.2.5 活性氧物质含量测定 将W2和ΔFreB2菌株的孢子以4.0×105个/mL浓度接种于YG液体培养基，混匀后以每孔200 μL接入96孔板，30 ℃培养12 h。用PBS清洗2次，分别加入浓度为100、200 mmol/L的H2O2200 μL/孔，30 ℃恒温孵育30 min后用PBS清洗2次，加入40 μmol/L DCFH-DA 50 μL/孔，37 ℃恒温避光孵育30 min，PBS清洗2次后置于荧光显微镜下观察。在荧光检测过程中选择多个视野进行细胞计数，分别记录总细胞数(N)和绿色荧光细胞数(Nf)，以此计算活性氧物质(ROS)阳性细胞的百分率(%)：

ROS阳性细胞百分率(%)=(Nf/N)×100%

2 结果与分析

2.1 Fe2+浓度与吸光值标准曲线

绘制 Fe2+浓度与吸光值标准曲线如图1所示，得出Fe2+浓度(x)与吸光值(y)之间的函数关系式为y=0.047 6x-0.007 4。

图1 二价铁浓度与吸光值标准曲线

2.2 金属还原酶活性

不同时间点和不同培养基培养的W2和ΔFreB2菌体内，金属还原酶活性不同。无铁AMM培养基培养时，ΔFreB2菌株在12～72 h间金属还原酶活性始终高于W2，且和W2菌株一样在36 h左右达到峰值。AMM培养基培养时，在24～72 h间ΔFreB2菌株金属还原酶活性高于W2，在60 h左右活性达到峰值(见图2)。

2.3 与铁吸收相关基因的mRNA表达变化

由图3可见，无论在无铁AMM培养基还是AMM培养基中，与W2菌株相比，ΔFreB2菌株与铁吸收相关基因MirB、SreA、SidA、FetC、FreB的表达量都出现上调，差异有显著性。

图2 不同菌株各时间点金属还原酶活性曲线Fig.2 The curve of metalloreductase activity of different strains over time

2.4 对氧化压力的敏感性

由图4可知，在AMM固体平板培养下，对照组W2菌株与ΔFreB2菌株生长情况无明显差异。而将W2菌株和ΔFreB2菌株孢子分别用不同浓度H2O2处理后，W2和ΔFreB2菌株的生长都受到不同程度的影响，但ΔFreB2菌株与W2菌株相比生长缺陷更明显，特别是H2O2浓度为100和200 mmol/L处理组。当H2O2浓度升为300、400和500 mmol/L时，W2和ΔFreB2菌株的生长都受到明显影响。ΔFreB2菌株与W2菌株相比，对H2O2的敏感性增强。

图3 与铁吸收相关基因的mRNA表达变化

2.5 活性氧物质含量

研究结果显示，未用H2O2处理时W2菌株和ΔFreB2菌株胞内均无明显的ROS产生现象，没有表现出荧光，如图5A。H2O2处理后ΔFreB2菌株中ROS阳性细胞数明显增多(图5D)。在100 mmol/L H2O2处理组(图5B)，ΔFreB2菌株ROS阳性细胞率为60%～70%，而W2菌株ROS阳性细胞率只有20%左右。在200 mmol/L H2O2处理组(图5C)，W2菌株和ΔFreB2菌株相比100 mmol/L H2O2处理组ROS阳性细胞率均有所升高，W2菌株为50%～60%，ΔFreB2菌株达到95%以上，ΔFreB2菌株ROS阳性细胞率仍明显高于W2菌株。

图4 W2菌株和ΔFreB2菌株对氧化压力的敏感性测定

Fig.4 The sensitivity of W2 and ΔFreB2 strains to oxidative stress

A：对照组；B：100 mmol/L H2O2处理组；C：200 mmol/L H2O2处理组；D：300 mmol/L H2O2处理组；E：400 mmol/L H2O2处理组；F：500 mmol/L H2O2处理组

A： untreated control；B：100 mmol/L H2O2treatment；C：200 mmol/L H2O2treatment；D：300 mmol/L H2O2treatment；E：400 mmol/L H2O2treatment；F：500 mmol/L H2O2treatment

图5 W2菌株和ΔFreB2菌株胞内活性氧物质测定

3 讨 论

铁离子作为人体必需的营养元素之一，是烟曲霉在宿主体内定殖、扩散及侵染等过程的重要决定因素。在对本金属还原酶基因FreB2的初步研究中发现，仅敲除该金属还原酶基因FreB2，突变株菌落及菌丝生长状况与野生型相比无明显变化[17]。本研究检测出ΔFreB2菌株金属还原酶活性比野生株高，且在无铁AMM中，野生株和ΔFreB2突变株金属还原酶活性峰值较AMM出现早。推测其原因可能是FreB2的缺失导致了其他铁吸收相关基因表达的改变。因此，选取了几个目前已知具有重要功能的铁吸收相关基因，检测其表达量。荧光定量PCR结果显示，相同培养条件下，突变株铁吸收相关基因如MirB、FetC、SidA、FreB的表达量均出现明显上调。由此得出可能是FreB2的缺失引起了突变株其他金属还原酶如FreB等表达量的升高。而这些铁吸收相关基因又受无铁环境诱导，所以导致金属还原酶基因在无铁AMM中的表达早于AMM。同时该结果也表明烟曲霉与铁吸收相关基因之间存在着一定的协同作用。或许这也是导致初步研究该基因功能时突变株菌落及菌丝生长状况与野生型相比无明显变化的原因。

烟曲霉的氧化压力应答机制是该病原真菌在各种环境压力条件下存活并正常生长代谢的重要保障。H2O2作为常用的凋亡诱导剂能够诱导真菌凋亡，细胞受氧化压力刺激后产生的ROS也可参与多种信号途径的活化，导致细胞凋亡[18-19]。已有报道，外源氧化剂存在的条件下细胞内DNA的损伤可能与细胞内可利用的铁离子浓度有关[2-3]。因为铁离子能够与细胞内的氧化成分如过氧化氢发生芬顿反应，产生氧自由基，诱导细胞凋亡[2-3]。本研究发现，ΔFreB2菌株对氧化压力的敏感性及ROS阳性细胞率均高于野生株。分析其原因，可能是由于表达量增多的其他高铁还原酶将更多的Fe3+还原成Fe2+，进而与过氧化氢发生芬顿反应，造成胞内ROS含量的上升，导致细胞凋亡。

本研究结果表明，烟曲霉金属还原酶基因FreB2与铁的吸收相关，且与铁吸收相关基因之间存在功能互补效应；该基因在氧化压力应答过程中也发挥重要的作用。至于该金属还原酶是如何参与氧化压力应答过程以及铁吸收相关基因之间具体的相互作用机制则还需要后续实验进一步证明。

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The Effects of Metalloreductase FreB2 on the Uptake of Iron and Response to Oxidative Stress inAspergillusfumigatus

WANG Wei-wei1, WU Cui-jiao1, ZHAO Wei2, ZHANG Shan-shan1, WANG Bin2

(1.Dept.ofHistol. &Embryol., 2.Dept.ofMicrobiol.,MedicalColl.QingdaoUni.,Qingdao266071)

The function of a metalloreductase gene FreB2 ofAspergillusfumigatuswas initially studied by the establishment of metalloreductase gene (AFUA-1G00350, FreB2) deletion mutant strain ofA.fumigatus, in order to explore the pathogenic relation ofA.fumigatusand the gene to provide foundation. The metalloreductase activity of wild type strain and gene deletion strain ofA.fumigatuswere compared in AMM and iron free AMM medium liquid during their growth for the activity of metalloreductase, and draw the metalloreductase activity curve of the wild type strain and gene deletion strain in AMM and iron free AMM liquid medium during their growth. Using Real-Time PCR to analyze the mRNA expression variation of SreA, SidA, FetC, FtrA, and FreB these related genes to iron assimilation was significantly up regulated. The sensitivity to oxidation stress experiment showed that the sensitivity of gene deletion mutant strain to H2O2was significantly strengthened, at the same time the intracellular active oxygen substance significantly increased. Metalloreductase FreB2 played role during the process of iron assimilation and oxidation stress response ofA.fumigatus; therefore, there existed a functionally mutual complementary effect onA.fumigatusand iron assimilation related genes.

Aspergillusfumigatus; metalloreductase; real-time PCR; ROS

国家自然科学基金项目(30840014)；教育部留学回国基金和山东省自然科学基金项目(ZR2010CM011)

王伟伟 女，硕士研究生。研究方向为细胞生物学。E-mail：weiweiw0212@126.com

* 通讯作者。吴翠娇 女，博士,硕士生导师。研究方向为组织学与胚胎学。Tel:0532-83780060, E-mail：wucjzr@163.com

2015-12-23；

2016-01-05

Q756；R379.6

A

1005-7021(2016)02-0008-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.002

赵巍 女，博士,硕士生导师。研究方向为微生物学。Tel:0532-83780059, E-mail：qduzhaowei@163.com