金乌散对小鼠免疫功能的影响

2016-12-21樊宏亮郝欣蔚吴烨挺赵红霞

中国兽医杂志 2016年10期

关键词：皮肤过敏溶菌酶发型

樊宏亮，郝欣蔚，吴烨挺，张雪，赵红霞

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018 ；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010080)

金乌散对小鼠免疫功能的影响

樊宏亮1，2，郝欣蔚1，吴烨挺1，张雪1，赵红霞1

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018 ；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010080)

为了对金乌散中药复方进行实验室药效学评价，我们开展了金乌散对小鼠免疫功能影响的研究。本试验采用碳廓清法测定金乌散对单核巨噬细胞吞噬功能的影响；采用比浊法测定金乌散对小鼠血清中溶酶菌含量的影响；采用迟发型皮肤变态反应法测定金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响；采用血清溶血素法测定对绵羊红细胞所致的小鼠溶血素抗体生成的影响。研究结果显示，金乌散对单核巨噬细胞的吞噬功能有显著的抑制作用，并能显著提高溶酶菌的含量，对迟发型皮肤过敏反应也有显著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，该中药组方可影响小鼠的非特异性免疫功能和特异性免疫功能。

金乌散免疫作用；小鼠

金乌散中药复方是针对呼和浩特周边地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌，以体外抑菌强度为测定指标，按照中兽医理论，采用正交试验，筛选出的具有良好抗菌作用的中药处方。其基础组方主要由金银花、乌梅、蒲公英等组成，各味中药相互配伍、协同，再加上各种辅药具有较强的抗炎作用。为了更加系统研究金乌散抗炎机理与免疫调节之间的联系，本课题从溶酶菌含量、迟发型皮肤过敏反应、溶血素抗体、碳廓清能力等方面研究了金乌散对小鼠非特异性免疫功能和特异性免疫功能的影响，旨在为金乌散的临床药效学研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂金乌散：以金银花、乌梅、连翘、蒲公英为主药并配以其他辅药、矫正药组合而成，经过实验室工艺制备，并将该中药制剂调整至浓度1.0 g/mL，放到4 ℃冰箱保存备用；地塞米松磷酸钠注射液：天津药业焦作有限公司生产，批号08051211；印度墨汁：北京市西中化工厂，批号为020809；20%绵羊红细胞悬液，由健康绵羊血制备而成。PBS 缓冲液，按文献[3-4]方法自行配制；Alsever溶液，按文献[1]方法自行配制。

1.2 动物豚鼠：体重400±50 g，雄性，由内蒙古生物制药厂提供；清洁级纯种昆明系小鼠：体重18±2 g，雌雄各半，由内蒙古大学实验动物中心提供；绵羊：由内蒙古农业大学兽医学院提供。

1.3 菌株腾黄微壁链球菌：代号为1.634，由中国医学科学院微生物研究所提供。

1.4 方法

1.4.2 金乌散对小鼠血清中溶菌酶含量的影响采用比浊测定法[6]，首先制备试验用腾黄微壁链球菌菌悬浮液。接种菌种，置37 ℃恒温培养箱内培养，洗下菌苔，3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，菌体用PBS洗3次，于波长600 nm比色。其次制备溶菌酶标准应用液。配成每毫升缓冲液中含有溶菌酶1 mg的原液，然后稀释成浓度为1、2、3、4、6 μg/mL 的标准应用液。最后测定样品。分组：给药剂量、给药途径同“1.4.1 分组及给药”。末次给药1 h 后，在无菌条件下采血，分离血清。取溶菌酶标准应用液及标本各0.1 mL，每管加基质液4 mL混匀，置40 ℃水浴2 min，立即混悬，用600 nm波长测t值，以腾黄溶壁链球菌浊度的变化在标准曲线上查出溶菌酶的活性值(即溶菌酶的浓度)。1.4.3 金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响采用迟发型皮肤变态反应法[3]进行试验。分组和给药方法同1.4.1。给药前用7% 2、4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液以0.02 mL/只鼠背部皮内注射致敏，连续给药11 d。末日给药1 h 后将1%DNCB 丙酮溶液0.02 mL/只涂于各小鼠右耳，24 h后处死，用直径为7 mm 的打孔器将两耳取下，分别称重，两耳的重量差为皮肤过敏反应强度的观测指标。同时取脾脏，称其鲜重，按公式计算脾脏指数，脾脏指数=脾脏质量/体重。

1.4.4 金乌散对绵羊红细胞所致的小鼠溶血素抗体生成的影响采用血清溶血素法测定[1,6]。分组和给药方法同1.4.1。首先，制备绵羊红细胞悬液(SRBC)和豚鼠补体血清，按文献[3]的方法进行。其次，给小鼠免疫及给药。连续给药7 d，于第2次给药后腹腔注射20%SRBC0。2 mL/鼠。于免疫后5 d，眼球取血，离心分离血清。最后测定溶血量。将血清稀释，在本试验中以1∶ 400 倍稀释作为正式试验的血清稀释度。吸取1∶ 400 倍稀释的血清各0.5 mL，依次加入其他试剂，混匀，温育1 h，冰浴5 min 终止反应，3 000 r/min 离心10min，取上清液于540 nm 处测定OD值，并按下列公式计算出溶血素含量。溶血素含量=样本血清的OD值×稀释倍数

1.4.5 数据统计分析采用SPSS 统计软件，对所有数据进行显著性检验，并进行分析比较，数据以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 金乌散对小鼠体内的单核—巨噬细胞吞噬功能的影响采用碳廓清法[3-5]测定金乌散对小鼠体内的单核—巨噬细胞吞噬功能的影响，并对数据进行统计分析，试验结果见表1。

表1 金乌散对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

组别剂量(g/kg)碳廓清指数K吞噬系数α阴性对照组200.0254±0.00132a4.805±0.4036a阳性对照组0.0050.0143±0.00105c4.117±0.3913c高剂量组200.0246±0.00194a4.768±0.3745a低剂量组100.0205±0.00213b4.451±0.2056b

注：相同字母表示差异不显著(P>0.05)；相邻字母表示差异显著(P<0.05)；相间字母表示差异极显著(P<0.01)，下表同

以上试验结果表明，低剂量的金乌散对小鼠体内单核-巨噬细胞的吞噬功能具有显著地抑制作用，而高剂量的金乌散则无明显作用。

2.2 金乌散对小鼠血清中溶菌酶含量的影响采用比浊测定法[7]检测各组小鼠血清中溶菌酶含量，并进行统计分析，结果见表2。

表2 金乌散对小鼠血清溶菌酶含量的影响 ±s)

以上试验结果表明，高剂量的金乌散能极显著的提高小鼠血清中溶菌酶含量，而低剂量的金乌散也可提高小鼠血清中溶菌酶的含量，但是其作用不显著。

2.3 金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响

采用变态反应法[3]检测各组小鼠耳壳肿胀度，计算脾指数，并进行统计分析，结果见表3。

表3 金乌散对小鼠两耳重量差和脾指数的影响±s)

以上试验结果表明，高、低剂量的金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应均有显著抑制作用，而且高剂量的金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应有极显著的抑制作用。

2.4 金乌散对绵羊红细胞所致的小鼠溶血素抗体生成的影响采用血清溶血素分光光度法[3-4]。检测各组小鼠血清抗绵羊红细胞抗体，并进行统计分析，结果见表4。

以上试验表明，高、低剂量的金乌散均能显著增加小鼠血清中溶血素的含量；而作为阳性对照的地塞米松则可导致小鼠血清溶血素含量显著降低。

表4 金乌散对小鼠血清溶血素含量的影响 ±s)

3 小结和讨论

巨噬细胞的吞噬、杀伤、抗原加工和呈递、合成和分泌各种活性因子的功能使得巨噬细胞在免疫方面起着相当重要的作用。另外巨噬细胞是机体非特异性免疫的标志物之一[2]。碳粒廓指数可以很好的反映机体巨噬细胞的吞噬功能。本试验中发现小剂量的金乌散对小鼠碳粒清水平有一定的抑制作用，而随剂量增加，抑制作用减弱甚至消失。溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一，参与机体多种反应，本试验结果表明，金乌散能提高小鼠血清中溶菌酶含量，且呈现一定的剂量相关性。

迟发型变态反应是第Ⅳ型变态反应又称接触过敏反应。研究表明，金乌散对小鼠迟发型皮肤过敏反应有显著抑制作用，且随着剂量的增加呈现显著的增强作用。血清溶血素的测定可以反映机体的体液免疫状态[8]，用药后，高、低剂量的金乌散均可使小鼠血清溶血素生成增多，表明机体体液免疫功能增强。综上所述，金乌散对单核-巨噬细胞的吞噬功能有显著的抑制作用，并能显著提高溶酶菌的含量，对迟发型皮肤过敏反应也有显著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，该中药组方可影响小鼠的非特异性免疫功能和特异性免疫功能，通过调节机体的免疫系统从而调节机体的免疫功能。

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2015-07-14

内蒙古农业大学博士启动基金