正交法优选具有抗巴氏杆菌活性黄连的提取工艺

裴青生 ， 曲 径 ， 殷中琼

(1.青海省畜牧兽医科学院 ， 青海西宁810016 ； 2.四川农业大学动物医学院 ， 四川成都611130)



正交法优选具有抗巴氏杆菌活性黄连的提取工艺

裴青生1， 曲 径2， 殷中琼2

(1.青海省畜牧兽医科学院 ， 青海西宁810016 ； 2.四川农业大学动物医学院 ， 四川成都611130)

为了筛选出中药黄连有效部位的最佳提取工艺，以提取物有效部位的浸膏得率与对巴氏杆菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为综合考察指标，采用正交实验对提取工艺中的料液比、提取次数、提取时间、乙醇浓度4个因素进行优选研究。黄连有效部位的最佳提取方法为：70%乙醇，料液比1:12，提取次数2次，每次1 h。在该工艺条件下进行提取，中药有效部位浸膏得率可以得到最大化保障，对巴氏杆菌的MIC和MBC值均小于等于15.6 mg/mL。

黄连 ； 有效部位 ； 正交试验 ； 提取工艺 ； 巴氏杆菌

多杀性巴氏杆菌是一种重要的动物病原菌，对畜禽养殖业有较大的危害，可感染各种家畜、家禽及野生动物，引起禽霍乱、猪肺疫、牛羊兔马及许多野生动物的败血症，并多与其他疾病混合感染或继发，导致严重的经济损失。目前主要采用抗生素进行治疗，但随着抗菌药物的广泛不合理应用，特别是将抗菌药物作为抗菌生长促进剂以次治疗剂量添加到饲料中，使巴氏杆菌表现为耐药率高、耐药范围广、呈多重耐药等特点，不仅给治疗和控制疾病带来困难，而且加剧了抗生素在动物体内的残留，严重危害了动物食品安全[1]。面对人类对健康的关注度越来越高，家畜家禽养殖行业中，绿色、无公害、无耐药性的新抗菌中兽药将逐步成为市场的主导。据研究报道，部分中药对常见的几种临床致病菌有一定的抑制效果[2-3]。本研究前期试验结果表明，黄连(RhizomaCoptidis)的有效部位提取物对巴氏杆菌有很好的抑菌效果。为了提高黄连对巴氏杆菌的抑菌活性，本研究对其有效部位的提取工艺进行优化，以便提高中药有效物质的产量，达到更好的抑菌效果。

目前，在对黄连等中药的提取工艺研究中，以测定中药有效成分含量为指标的研究较多[6]，以浸膏得率为指标的提取工艺研究较少，综合文献资料，本研究以溶剂浓度、料液比、提取次数、提取时间为影响因素，采用正交实验，以浸膏得率及对巴氏杆菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)为指标，根据综合指标得到最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 药材 黄连 RhizomaCoptidis(四川，批次080406)，购自成都中药市场。

1.2 试验菌种 巴氏杆菌Pasteurella(C481)，四川农业大学动物医学院药学系提供。

1.3 主要试剂 无水乙醇、二甲亚砜等，购自成都市科龙化工试剂厂；营养琼脂、营养肉汤培养基等，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.4 方法

1.4.1 黄连有效部位最佳提取工艺筛选 以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)及提取次数(D)为考察对象，并根据相关文献[4]，拟定各因素的三水平(见表2)，以提取有效物质的浸膏得率，MIC和MBC值为综合考察指标，选用L9(34)正交实验表进行试验，从而筛选出最佳的提取工艺。

按规定量称取药物9份，每份约30 g，分别粉碎并编号1、2、3、4、5、6、7、8、9，精确称量9份药物粉末，将药物粉末于溶媒中加热回流提取，每组各提取1次，浓缩滤液至糊状，放入55℃烘箱中3 d，烘干至浸膏状态，称重并计算得率，封存备用，分别重复9次。

表1 四因素三水平表

1.4.2 黄连对巴氏杆菌的体外药敏试验 细菌悬液的制备：对巴氏杆菌肉汤纯培养物进行10倍递减稀释，平板计数后，制成菌悬液,并调整其浓度约为106cfu/mL(每毫升的菌落形成单位，Colony-formingunits/mL),备用。

抗菌药液的制备：将黄连的中药提取物浸膏溶于二甲亚砜中，配制成质量浓度为1 g/mL的储备液，100 ℃高压蒸汽灭菌，4℃冰箱保存备用。

药敏试验：取无菌试管20支，分为试验组和对照组，每组10支。无菌操作吸取l mL肉汤(含10%小牛血清)分别加于试验组10支试管中，吸取已稀释好的药物1 mL加入第1管，混匀后依次倍比稀释至第9管，使终浓度为1.95 mg/mL，第10管不加药物为对照管。对照组操作同试验组。用微量加样器取已校正浓度的菌液0.1 mL，依次由低浓度向高浓度加到试验组各管中，混匀后，置于37 ℃培养箱培养24 h后分别观察细菌的生长状况，以浑浊度为指标，以对照组为参考对象，检查试管中有无细菌生长，以药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验菌最低抑菌浓度MIC。将MIC测定中判定未生长细菌的试验组中药肉汤0.1 mL接种涂布于加小牛血清的营养琼脂平板上，37 ℃条件下培养24 h，观察结果，以未长细菌菌落的管内药物浓度为最低杀菌浓度MBC[5]。

2 结果

2.1 黄连有效部位提取工艺的优选 通过对黄连提取物各浸膏得率的计算，得出每个正交号的浸膏得率，分别计算各组试验结果的综合平均值K1、K2、K3及极差R1；通过对巴氏杆菌抑菌活性和杀菌活性的测定，得出每个正交号的MIC、MBC值，以MIC及MBC的和为药敏试验结果考察指标，分别计算各组试验结果的综合平均值K1′、K2′、K3′及极差R2，并对其进行方差分析，结果见表2和表3。

表2 以浸膏得率和MIC与MBC值之和为指标的试验L9(34)直观分析

表3 以浸膏得率和MIC与MBC值之和为指标的试验L9(34)的方差分析1

4个因素对黄连提取物得率的影响大小顺序为：D>A>C>B，以得率为指标的最优水平组合为D2A2C1B3，即70%乙醇，料液比为1:12，提取2次，每次1 h。4个因素对MIC值与MBC值和的影响大小顺序为：A>C>B>D，以MIC值与MBC值和为指标的最优水平组合为D3B3C3A3，即90%乙醇，料液比为1∶12，提取3次，每次2 h。

通过以上分析可知，筛选出的2个组合，因素水平的不同在于因素A、C、D，即乙醇浓度、提取时间、提取次数，其对得率影响最大，对药敏影响很小。综合以上分析，D2A2C1B3为提取黄连有效部位的最佳提取工艺因素水平组合，即70%乙醇，料液比1:12，提取次数2次，每次1 h。

2.2 最优组合的验证 按最优组合对黄连有效部位进行提取，重复3次，计算每组得率、MIC和MBC值，其结果见表4。

表4 最佳提取工艺下的黄连提取物对巴氏杆菌的MIC和MBC值

由表4可得出，在最佳提取条件下，3次验证试验的得率非常接近，且均大于正交试验组最高得率，MIC值和MBC值均属于正交试验中最小值或较小值。由此可知，正交试验筛选出来的提取工艺为最佳工艺，且该提取工艺稳定，所得的综合指标评价最好。

3 讨论

本试验主要是以提取物的浸膏得率及其对巴氏杆菌的MIC和MBC值作为评价指标，综合探讨了黄连有效部位的最佳提取工艺方法，为制剂的制备、质量标准的建立以及黄连与其他中药复方治病机理的研究奠定基础。

黄连有效部位提取工艺正交试验结果表明，按照正交实验设计原理，选择提取时间、提取次数、料液比和溶媒浓度4个因素的3个不同水平，分别以有效部位的提取率及其对巴氏杆菌的MIC和MBC值作为评价标准，获得了黄连有效部位的最佳提取工艺。按照中药提取条件的常规设计[6]，料液比的设计为1∶5～30，提取次数越多提取越充分，而提取时间、溶媒浓度则与提取物的种类有关[7-8]。本研究结果中料液比、提取次数与常规提取设计相符合，表明了设计的合理性。黄连对巴氏杆菌标准菌的杀菌和抑菌结果表明，其具有较好作用，为临床应用提供了依据。

本研究主要以对巴氏杆菌的抑菌和杀菌活性以及有效部位的得率为指标衡量提取方法的优越性，客观上还有其他指标可以用来衡量提取工艺，比如主要成分得率、有效部位对其他类型致病菌的抑菌效果等，有关这部分内容以及对其制剂的开发、质量标准的建立以及确切疗效的研究工作正在进行中。

[1] 张琼文,杨昌宏,符曼萍.牛猪多杀性巴氏杆菌病的诊治[J].中国兽医杂志,2000.2:100-102.

[2] 袁心红．16种中药及其组方对临床常见致病菌的抑菌作用探讨[J]．中国中医药咨讯,2012,4(2):234-235.

[3] 刘荣欣,鲁改儒,郭吉勇,等.中药及其组方对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].安徽农业科学,2011,39(4):2265-2267.

[4] 涂瑶生,江志强,孙冬梅,等.黄连生物碱提取及纯化工艺研究[J].中药研究,2012(23)：208-209.

[5] 刘璐,陈静,陈丽杰.黄芩、五倍子、黄连体外抑菌活性的研究[J].中国中医药科技,2011,18(5):424-425.

[6] 刘芳,刘斌,王毅.常规统计学方法在优化中药提取工艺中的应用[J].中南药学,2009,8(7)：615-617.

[7] 李文兰,范玉奇,季宇彬,等.匀设计法优选川芎中阿魏酸和总酚酸的提取工艺[J].中国现代应用药学杂志,2007,4(3)：98-201．

[8] 张颖,张兆旺.均匀设计法优选左金丸方药的半仿生提取工艺[J].中国中药杂志,2008,33(4)：466-469.

Extraction Technology ofantiPasteurellaactivity ofRhizomaCoptidisby Orthogonal design

PEI Qing-sheng1， QU Jing2， YIN Zhong-qiong2

(1.Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China;2.College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The aim of this study was to screen the best extraction procedure for antiPasteurellaactivity ofRhizomacoptidiseffective parts.The extract yield of effective parts,minimal inhibitory concentration(MIC)of extracts onPasteurellaand the minimum bactericidal concentration(MBC)of extacts onPasteurellawere used as the three indicators for comprehensive evalu-ation.The optimized extraction procedure was screened by orthogonal design with four factors,the solid-liquid ratio,extraction time,time of extractionand concentration of ethanol.Our result showed that the optimized concentration of ethanol was 70%,the solid-liquid ratio was 1:12,and the extraction time was 2 times of,1-hour extraction.In these conditions,Rhizomacoptidiseffective parts are maximum,and MIC and MBC values for pasteurella are less than or equal to 15.6 mg/mL.

Rhizomacoptidis； effective parts ； orthogonal design. ； extraction procedure ；Pasteurella

YIN Zhong-qiong

2015-11-12

“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011BAD34B03);四川省青年科技创新研究团队(2013TD0015);青海省科技计划项目(2013-N-148)

裴青生(1960-)，男，副研究员，本科，主要从事动物生态养殖相关技术研究,E-mail:mkypqs@163.com

殷中琼，E-mail：yinzhongq@163.com

R282

A

0529-6005(2016)10-0086-03