乌骨藤提取物对原代新生大鼠心肌细胞的毒性研究

许晓东 李凯强 王震 张昱 陈波旭 陈秉宇 郑宇 张威

●论 著

乌骨藤提取物对原代新生大鼠心肌细胞的毒性研究

许晓东 李凯强 王震 张昱 陈波旭 陈秉宇 郑宇 张威

目的 探讨乌骨藤提取物（MTE）对原代新生大鼠新生心肌细胞的毒性影响。方法 分离和培养SD大鼠心肌细胞，将MTE组分A溶于二甲基亚砜，分别使用20、40、80、160和320μg/ml的MTE和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶作为阳性对照处理原代大鼠心肌细胞24 h，采用MTS法测定不同浓度MTE对体外培养原代大鼠心肌细胞增殖的影响；采用RTCA Cardio系统建立体外心脏毒性筛选模型，对大鼠心肌细胞增殖、搏动进行检测。结果 原代心肌细胞加入不同浓度的MTE后，细胞存活受到显著抑制，半数存活浓度（EC50）为207.3μg/ml，随着MTE浓度的升高组分A抑制率增强（均P＜0.05）。原代心肌细胞接种到RTCA Cardio E-Plate96孔板上，24h后出现心肌细胞搏动。MTE处理后，细胞指数（CI）值显著下降，240μg/ml MTE组分A处理后心肌细胞搏动迅速受到抑制，搏动频率由126次/min下降至0次/min，且不可恢复；160μg/ml和80μg/ml处理后分别在12h和6h后抑制作用减弱，搏动频率为40次/min和84次/min；40μg/ml基本无影响。结论 MTE组分A对原代新生大鼠心肌细胞具有细胞毒作用，能够显著影响其搏动功能。

心肌细胞 RTCA 细胞毒性 乌骨藤

心脏是循环系统中重要的功能性器官之一，临床药 物的细胞毒性可不同程度增加心脏的循环压力，甚至会引起心肌细胞不可逆的损伤和缺失，导致患者心功能进行性恶化。建立心脏实时细胞分析系统（RTCA Cardio）技术能对临床药物心肌细胞毒进行有效筛选，降低心血管疾病导致的病死率[1]。乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物，具有抗肿瘤、平喘、免疫调节和降血压等药理作用[2]。以乌骨藤的粗提物（MTE）为主要成分的药物“消癌平”临床上用于治疗肝癌、胶质瘤、胃癌等肿瘤[3]。但MTE对心肌细胞的细胞毒作用尚不清楚，进一步分离纯化乌骨藤，利用RTCA Cardio技术评估MTE的心肌细胞毒作用，有助于以乌骨藤为主要成分药物的减毒增效。本研究采用RTCA Cardio技术对原代大鼠心肌细胞的增殖、搏动频率、幅度等进行实时动态检测，探讨MTE对原代大鼠心肌细胞的细胞毒作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料和动物 MTE经萃取和色谱分离，获得主要组分A，由浙江工业大学药学院纯化和提供；出生后1～2d清洁级SD新生大鼠，雌雄不限，由浙江省实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞的分离和培养 取出生1～2d的SD大鼠，用75%乙醇消毒后，获取大鼠心室组织，剪成1mm左右的组织块，使用预冷的高糖培养基洗涤3次，用0.08%胰蛋白酶和0.04%胶原蛋白酶Ⅱ消化后将细胞悬液收集到培养瓶中进行差速贴壁2次，每次45min，以去除成纤维细胞和其它细胞。将差速贴壁后的心肌细胞悬液转移至50ml离心管中进行细胞计数。

1.2.2 新型四氮唑盐（MTS）法检测存活细胞抑制率 将MTE组分A溶于二甲基亚砜（DMSO）备用，实验时分别使用20、40、80、160和320μg/ml浓度的MTE组分A和8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）作为阳性对照处理原代大鼠心肌细胞24h，采用MTS法测定吸光度（OD）值，计算存活细胞抑制率[2]。实验重复3次，取平均值，并计算半数存活浓度（EC50）。

1.2.3 RTCA Cardio系统基线的测定及大鼠心肌细胞细胞指数（CI）值、搏动检测 在E-Plate Cardio96x检测板中分别加入50μl培养基，将其放在Cardio工作站上，测基线调零。取出E-Plate Cardio96x检测板，分别加入100μl细胞悬液（17 000cells/孔）于E-Plate Cardio96x检测板中，混匀，室温放置30min后，放在Cardio工作站上对不同时间的细胞增殖进行实时动态检测。24h后，取出E-Plate Cardio96x检测板，分别加入不同浓度MTE组分A（40、80、160、240μg/m）l和DMSO对照（0.1%），放在Cardio工作站上对心肌细胞CI和心肌细胞搏动频率进行实时检测和信号收集，并通过RTCA Cardio software 1.0对以上指标进行分析。CI值用来反映细胞增殖情况，CI值越大，细胞增殖越多。每隔2min检测1次，分别选取0、10、30min及2、6、12、18、24h时间点作图。

1.3 统计学处理 采用Prizm 5软件和RTCA Cardio software 1.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 MTE组分A对原代大鼠心肌存活细胞抑制率的影响 通过Prizm 5软件计算得出MTE组分A对原代大鼠心肌细胞的EC50为207.30μg/ml。MTE组分A对原代大鼠心肌存活细胞抑制率的影响见表1。

表1 MTE组分A对原代大鼠心肌存活细胞抑制率的影响

由表1可见，与DMSO对照组比较，20、40、80、160和320 μg/ml组MTE组分A及5-FU（8 000μg/ml）对照组对原代大鼠心肌存活细胞抑制率的差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随着MTE组分A浓度的升高存活细胞抑制率升高（均P＜0.05）。

2.2 RTCA Cardio检测MTE组分A对原代大鼠心肌细胞增殖的影响 见表2。

表2 RTCA Cardio检测MTE组分A对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

由表2可见，随着MTE组分A浓度的升高，CI 值下降，存在药物浓度依赖性。160μg/ml组、240μg/ml组与DMSO对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 MTE组分A对原代大鼠心肌细胞搏动的影响 见图1，表3、4。

图1 MTE组分A对原代大鼠心肌细胞的瞬态脉冲图

表3 MTE组分A对原代大鼠心肌细胞标准搏动频率的影响

表4 MTE组分A对原代大鼠心肌细胞标准搏动幅度的影响

由图1，表3、4可见，MTE组分A各浓度组对心肌细胞搏动均有一定的影响，且该影响作用呈浓度依赖性：240μg/ml组经处理后，导致细胞迅速停止搏动，搏动频率由126次/min降至0次/min，标准搏动幅度由100%降至0，且无法恢复；160μg/ml组经处理后，12h内显著影响细胞搏动频率和搏动幅度，搏动频率和标准搏动幅度分别为40次/min和128%，18h后恢复正常；80μg/ml组经处理后，2h内对心肌细胞搏动频率和搏动幅度还存在一定的影响，但6h恢复正常，搏动频率和标准化搏动幅度分别为84次/min和109%；40μg/ml组经处理后几乎对细胞搏动无影响。

3 讨论

药物浓度的筛选是心功能不全患者治疗效果不佳的重要原因之一[4]，尤其是在肿瘤患者中，化疗药物在为控制肿瘤患者病情，提高生存质量的同时，往往直接或者间接地损伤心肌细胞，导致心脏传导和收缩功能障碍[5]。笔者的前期研究发现，MTE能够显著抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖，通过调控Bcl-2家族mRNA表达的变化，促进C6细胞发生凋亡[6]。但关于乌骨藤对心肌细胞的作用仍不明确，鲜有报道。本研究利用RTCA Cardio技术探究乌骨藤提取物对原代新生大鼠心肌细胞增殖和功能的变化。该技术模拟生理条件下，根据细胞与E-Plate Cardio96检测板底部电极相互作用引起阻抗的变化换算成CI值，对心肌细胞进行实时、无标记、无侵入性的动态监测[7]，从而获得细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等细胞生理功能相关的信息[8]。通过实时监控细胞增殖、凋亡和毒性等事件，可以提供丰富的细胞生理信息[9]，并根据心肌细胞搏动频率、幅度变化进行评估，综合分析药物对心肌细胞的生长、细胞形态特征和心肌细胞搏动的影响，可早期进行临床药物对心脏毒性的筛选，有效减少药物的浪费[10]。我们通过RTCA Cardio系统检测发现，MTE组分A能够抑制心肌细胞的CI值，抑制细胞的增殖，这与MTS实验结果一致，进一步说明了乌骨藤提取物具有细胞毒作用。进一步研究发现，高浓度MTE组分A能够导致心肌细胞搏动消失，且随着时间的延长不能恢复，但是中、低浓度处理后，导致的初始阶段心肌细胞搏动消失，随着时间的延长，可有一定程度的恢复，且具有浓度依赖性。160μg/ml MTE组分A对原代大鼠心肌细胞具有细胞毒作用，并能显著抑制其搏动频率和幅度，该浓度远超过其临床应用剂量，提示以乌骨藤提取物为主要成分的消癌平对心肌细胞较为安全。

综上所述，乌骨藤制剂在抗肿瘤的同时存在心肌细胞毒作用，能够显著影响心肌细胞搏动频率和搏动幅度，提示在临床治疗过程中，乌骨藤制剂抗肿瘤最佳剂量的筛选尤为重要。

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[5]Mordente A,Meucci E,Martorana G E,et al.Human heart cytosolic reductases and anthracycline cardiotoxicity[J].IUBMB life,2001,52(1):83-88.

[6]王震,李凯强,陈秉宇,等.乌骨藤粗提物对大鼠胶质瘤C6细胞的体外实验研究[J].浙江医学,2015,37(10):809-819.

[7]Xi B,Wang T,Li N,et al.Functional CardiotoxicityProfiling and ScreeningUsing the xCELLigence RTCA Cardio System[J].J Lab Autom,2011,16(6):415-421.

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Cytotoxic effect of Marsdeniae Tenacissimae Extracts on primary cultured myocardial cells of neonatal rat

XU Xiaodong, LI Kaiqiang,WANG Zhen,et al.Research Center of Blood Transfusion,Key laboratory of Ministry of Education,Zhejiang Provincial People's Hospital.Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the cytotoxic effect of Marsdeniae tenacissimae extracts(MTE)on primarily cultured myocardial cells of neonatal rats. Methods Primarily cultured myocardial cells of neonatal SD rats were treated with 20,40,80, 160 and 320μg/ml MTE,and 8 000μg/ml 5-FU(positive control),cell proliferation was assessed by MTS method.Cytotoxicity and rhythm changes of myocardial cells were determined by Real-time Cellular Analysis Cardio(RTCA Cardio)system. Results Proliferation of rat myocardial cells was inhibited after MTE treatment in a concentration-dependent manne(P＜0.05),and the half survival rate(EC50)was 207.3μg/ml.RTCA Cardio system showed that myocardial cells were beating normally 24h after testing started.And the cell index(CI)was down-regulation significantly with MTE.The cells beating rate decreased frequently from 126 to 0 beatings/min with the treatment of 240μg/ml MTE component A.When the cells were treated with 160μg/ml and 80μg/ml component A,the cell beating was resumed at 12h and 6h with a beating rate of 40 beatings/min and 84 beatings/min, respectively. Conclusion MTE component A has cytotoxic effect on primary cultured myocardial cells of neonatal rat,and significantly affects the beating function of myocardium.

Myocardial cellRTCA Cytotoxicity Marsdeniae tenacissimae extraction

2016-04-14）

（本文编辑：马雯娜）

国家自然科学青年基金（81501824）;浙江省自然科学基金项目（LY15C090004,LY15H280003）；浙江省中医药重点项目（2015ZZ001）；浙江省中医药项目（2014ZQ005，2014ZB007）；浙江省医药卫生科技计划项目（2016DTB001,2015KYA028，2015ZDA002）

310014 杭州，浙江省人民医院检验医学教育部重点实验室输血医学研究中心（许晓东、李凯强、陈秉宇、王震、张威）；温州医科大学第一临床医学院（张昱、陈波旭、郑宇）

张威，E-mail：mnfizjpph88@163.com