分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性

行 璇，刘雄伦，3*，陈海龙 ，杨丰宇，李永聪，廖 花，游 亮，刘金灵，3，戴良英，王国梁，3

(1 湖南农业大学农学院，长沙 410128； 2 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128；3 南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙 410128； 4 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)



分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性

行 璇1，2，刘雄伦1，2，3*，陈海龙1，2，杨丰宇1，2，李永聪1，2，廖 花1，2，游 亮1，2，刘金灵1，2，3，戴良英2，3，4，王国梁1，2，3

(1 湖南农业大学农学院，长沙 410128； 2 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128；3 南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙 410128； 4 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)

根据已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9的DNA序列设计功能标记Clon2-1，通过分子标记辅助选择开展回交育种实践，定向改良水稻恢复系R288的稻瘟病抗性。获得如下结果：Clon2-1为共显性标记，在Pi9基因供体亲本75-1-127和受体亲本R288之间多态性明显且稳定；Clon2-1标记基因型对稻瘟病抗性表型的选择效率达100%。通过分子标记辅助选择和连续回交自交，获得了含Pi9基因的BC6F3群体，在此基础上筛选鉴定出1个高抗稻瘟病水稻新品系‘R288-Pi9’，用其与培矮64S配组获得的杂交组合同样表现出高水平稻瘟病抗性。

水稻；稻瘟病抗性；Pi9基因；分子标记辅助选择育种

水稻(OryzasativaL.)是全球的重要粮食作物[1]。稻瘟病(rice blast disease)是水稻生产中最严重的病害之一，它地理分布范围广，并且可以发生在水稻生长的各个时期，是水稻高产稳产的主要限制因素[2]。长期实践表明，解决稻瘟病危害最有效、经济、环保的策略是发掘、鉴定和利用广谱持久抗性基因，选育和推广抗病品种[3，4]。然而，水稻稻瘟病抗性是典型的质量数量性状，容易受环境影响，常规抗病育种中对表型选择不准确，育种效率低。分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)育种，即利用与基因连锁(或基因内)标记，在育种过程中对目标单株进行标记基因型鉴定和选择，尤其是共显性分子标记还能有效鉴定纯合基因型，可以大大提高育种效率、缩短育种周期，常用于连续回交育种定向改良受体目标性状，是现代分子育种的重要手段[5，6]。Pi9是一个已克隆的广谱持久抗稻瘟病基因，位于水稻第6号染色体短臂靠近着丝粒位置的Pi2/9位点[7，8]。本研究以籼稻品系75-1-127作为Pi9基因供体亲本，水稻恢复系R288作为受体亲本及轮回亲本，利用Pi9分子生物学信息开发基因内特异DNA标记开展MAS育种实践，以期改良R288及其杂交种的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Pi9基因供体亲本75-1-127；Pi9基因受体亲本及轮回亲本R288；稻瘟病感病对照水稻品系CO39；蜀恢527/75-1-127的BC6F1群体(用于分子标记选择效率分析)、R288/75-1-127的BC6F3群体、改良纯系R288-Pi9及其所配杂交种培矮64S/R288-Pi9；17份来自不同稻区的稻瘟菌菌株(表1)。

1.2 方法

1.2.1 分子标记的开发

Pi9属于NBS-LRR 类基因，含有2个内元，长度分别为5362 bp和128 bp；cDNA 全长4009 bp，包括3099 bp的编码区和910-bp 3′ UTR。本研究根据Pi9基因序列设计和筛选了一个基于PCR技术的共显性特异功能标记Clon2-1，分析Clon2-1在75-1-127和R288之间的多态性及其基因型辅助选择效率，并用于MAS育种。

1.2.2 室内接种及田间病圃表型鉴定

为分析供试水稻材料的稻瘟病抗性及抗菌谱，进行室内接种。将75-1-127、R288和感病对照CO39分别播种于添加了花卉营养土的塑料育苗盘中，在26～28℃，12 h光照的人工气候室中培养。4叶期，用0.02%的吐温水溶液配制浓度约1×105/mL的单个小种(菌株)稻瘟菌分生孢子悬浮液，室内喷雾活体接种。接种后在温度为26℃的条件下先暗培养24 h，再进行5～6 d的正常光照且高湿度培养。感病对照CO39出现明显病斑后，参照Bonman[9]的0～5级标准调查抗病反应表型(0～2级为抗病类型，3～5级为感病类型)。

抗性频率计算：

抗性频率=成功接种后表现不致病小种(菌株)数÷接种小种(菌株)总数×100%

2015～2016年连续两年，于5～6月份在浏阳大围山天然病圃完成各供试材料的田间苗瘟抗性鉴定。2015年重点分析鉴定R288/75-1-127的BC6F3群体抗性及其分离情况，筛选抗病纯系；2016年重点鉴定杂交种培矮64S/R288-Pi9的稻瘟病田间抗性。5月中旬播种，6月中旬调查抗性表型，抗性评价标准同上。

1.2.3 模板DNA提取及标记基因型鉴定

对75-1-127、R288及回交或自交群体随机单株，各取约0.2 g 新鲜嫩叶置于2.0 mL离心管中液氮研磨，CTAB法[10]提取总DNA。

利用Clon2-1标记引物对各DNA样品做PCR扩增。PCR反应体系(10 μL)：DNA模板1.0 μL，5 U/μL 大连宝生物r-Taq 0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10 Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR反应程序：94℃ 5 min预变性；94℃ 30 s变性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35个循环；72℃终延伸 7 min。

扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析基因型。

1.2.4 分子标记Clon2-1的选择效率分析

为分析分子标记Clon2-1的辅助选择效率，2015年用蜀恢527×75-1-127 的BC6F1群体，在病圃诱导发病后随机调查各单株抗性并编号，随后用Clon2-1分析各单株标记基因型，结合各单株基因型与抗性表型对应结果，分析Clon2-1的选择效率。

1.2.5 改良抗病纯系的鉴定与筛选

利用分子标记Clon2-1，于2009～2014年经长沙—三亚两地开展MAS育种实践，于2014年获得R288/75-1-127的BC6F2群体，并进一步单株套袋自交获得14个BC6F3株系。2015年夏季在浏阳大围山病圃做抗性表型鉴定后，结合单株基因型确认，获得抗病纯系，并根据田间主要农艺性状表现，筛选优良抗病纯系。

1.2.6 改良抗病纯系主要农艺性状调查

2015年通过田间记载和取样分析，比较获选优良抗病纯系与受体亲本R288的主要农艺性状。两个群体各随机选取15株定点调查分析，农艺性状包括全生育期、株高、剑叶长宽比、穗长、单株有效穗数、每穗总粒数、千粒重。记载考种标准按文献[11]，相关数据采用Excel和DPS软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 供试亲本水稻的稻瘟病抗性表现及抗菌谱

利用17份来自国内外不同稻区的稻瘟菌菌株分别对Pi9基因供体亲本75-1-127、受体亲本R288及感病对照CO39进行室内接种，结果表明各供试水稻材料的抗性表现和抗菌谱差异非常显著(表1)。75-1-127对其中15份菌株表现高水平抗性，但对来自韩国的ROR1和来自日本的KOH两份菌株表现感病，抗性频率为88.2%。受体亲本R288只对其中6份菌株表现抗病，抗性频率为35.3%，表明其稻瘟病抗性亟待改良。但有意思的是R288对KOH表现抗病，暗示R288中可能存在别的稻瘟病抗性基因。感病对照CO39对所有供试菌株均表现感病。田间病圃稻瘟病抗性鉴定结果显示，75-1-127表现高水平持久抗性，而R288和CO39高度感病。

表1 供试水稻亲本材料的稻瘟病菌抗谱Table 1 Resistance spectrum of two rice parents to seventeen M.oryzae isolates

(续表1)

2.2 分子标记Clon2-1的多态性及选择效率

用Clon2-1标记引物分别对供体和受体亲本的基因组DNA模板做PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析标记基因型，结果在75-1-127基因组中扩增出一条约500 bp的稳定清晰条带，而在R288基因组中获得一条约850 bp的扩增产物(图1)。表明Clon2-1是一个在双亲间多态性明显且稳定的共显性DNA标记，可用它开展分子标记辅助选择育种改良受体亲本的稻瘟病抗性。

图1 分子标记Clon2-1在双亲间的多态性表现Fig.1 Polymorphism produced by marker Clon2-1 between two parents

为检验Clon2-1的辅助选择效率，将蜀恢527/75-1-127 BC6F1群体的随机取样单株分别做病圃表型鉴定和标记基因型分析。结果表明Clon2-1在BC6F1的全部5个抗病单株中均扩增出两条分别来自两个亲本的特异条带，显示为杂合基因型；全部7个感病单株中均只扩增出一条来自受体的特异条带，显示为纯合基因型(图2)。表明本试验中Clon2-1的标记基因型对抗病性表型选择效率达100%。

图2 分子标记Clon2-1对抗性表型的选择效率分析Fig.2 Selection efficiency analysis of molecular marker Clon2-1 for phenotype

2.3 改良抗病纯系的鉴定与筛选

利用Clon2-1开展连续多年的MAS育种实践，于2014年得到R288/75-1-127的BC6F2群体，在此基础上获得14个BC6F3株系。2015年对14个BC6F3株系进一步做单株基因型分析和病圃表型鉴定，获得3个遗传稳定的抗病纯系，并结合田间农艺性状调查筛选出1个优良抗病纯系R288-Pi9(图3，图4)。

图3 改良抗病纯系R288-Pi9的鉴定Fig.3 Identification of the improved blast resistant homozygous line R288-Pi9

2.4 改良抗病纯系R288-Pi9的主要农艺性状表现

田间观察记载及取样初步分析结果表明，改良抗病纯系R288-Pi9与受体R288之间，主要农艺性状表现均无显著性差异(表2)，表明经过连续多代回交与自交，两者遗传背景已经非常相似，除Pi9基因差异外，两者已是近等基因系，达到了定向改良R288稻瘟病抗性的目标。

表2 改良抗病纯系R288-Pi9与受体亲本R288主要农艺性状比较Table 2 Main agronomic traits analysis of R288-Pi9 and its receptor

2.5 杂交种的抗病性表现

2016年6月浏阳大围山病圃抗性鉴定结果表明，用改良抗病纯系配制的杂交组合“培矮64S/R288-Pi9”表现出与Pi9基因供体亲本一样的高水平抗性；而用受体亲本R288配制的杂交种“培矮64S/R288”表现为高度感病(图4)，说明Pi9基因的显性抗性性状能稳定遗传，通过MAS育种不但可以改良受体亲本的稻瘟病抗性，而且可以改良杂交种的抗性，在水稻稻瘟病抗性杂种优势利用中具有广阔的应用前景。

图4 改良抗病纯系R288-Pi9及其杂交种的田间病圃抗性表现Fig.4 Blast resistance performance of R288-Pi9 and its hybrid in nursery

3 讨论

水稻稻瘟病抗性是典型的质量数量性状，容易受环境影响，常规育种中的表型选择往往不准确，育种效率低。MAS育种是通过标记基因型分析和选择代替表型选择，选择准确性和育种效率大大提高。本课题组自2009年以来，利用已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9和已精细定位的广谱持久抗瘟基因Pigm的分子生物学信息，开发出了多个高效分子标记，用它们开展MAS育种实践，定向改良一批感病水稻品种(特别是杂交稻亲本)的稻瘟病抗性，效果很好[12～15]。本研究中，Clon2-1标记基因型对抗病性表型的选择效率达100%，用该标记在各回交及自交世代中连续辅助选择，育成了一个抗病新品系‘R288-Pi9’，为进一步培育抗病水稻新品种(组合)奠定了基础。

由于稻瘟菌小种的多样性及快速变异性，一定程度上限制了稻瘟病抗性基因和抗性水稻品种的推广应用，而聚合育种是解决这个问题的有效策略。应在现有工作基础上，开展以分子标记辅助选择为基础的多基因聚合育种，以培育具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻新品种(组合)。

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Improving Blast Resistance of Rice Restorer R288 by Molecular Marker-Assisted Selection ofPi9 Gene

XING Xuan1，2，LIU Xionglun1，2，3*，CHEN Hailong1，2，YANG Fengyu1，2，LI Yongcong1，2，LIAO Hua1，2，YOU Liang1，2，LIU Jinling1，2，3，DAI Liangying2，3，4，WANG Guoliang1，2，3

(1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；3 Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops，Changsha，Hunan 410128，China；4 College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

To improve blast resistance of rice restorer line R288，an inner-gene functional marker Clon2-1 was designed based on DNA sequence of the cloned broad-spectrum blast resistance genePi9，and molecular marker-assisted breeding was implemented.The main results were as the follows：Clon2-1 is a co-dominant marker and showed obviously and stable polymorphism betweenPi9 gene donor parent 75-1-127 and the receptor R288，and selection efficiency of Clon2-1 marker genotype for rice blast resistance phenotype reached 100%.The BC6F3population harboringPi9 with R288 background was developed through consecutive backcross and self-pollination，and thereupon a resistant homozygous line R288-Pi9 was bred.The hybrid produced by R288-Pi9 and the photo-thermal sensitive genic male sterile line Peiai 64S，also showed high-level blast resistance.

rice；blast resistance；Pi9 gene；molecular marker-assisted selection breeding

2016-06-12

行 璇(1990-)，女，硕士研究生，Email：1003624951@qq.com。*通信作者，Email：xionglun@hunau.edu.cn。

国家自然科学基金(3l171526)；国家转基因生物新品种培育重大专项(2015ZX08001-002)；湖南省重大专项(2015NK1001)；教育部高校创新团队发展计划(IRT1239)。

S511.035.3

A

1001-5280(2016)05-0487-05

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.02