利用SSR标记构建水稻核心亲本指纹图谱

曾晓珊，彭 丹，石媛媛，谢 伟，刘爱民

(袁隆平农业高科技股份有限公司，湖南长沙 410006)



利用SSR标记构建水稻核心亲本指纹图谱

曾晓珊，彭 丹，石媛媛，谢 伟，刘爱民*

(袁隆平农业高科技股份有限公司，湖南长沙 410006)

利用农业行业标准(NY/T 1433-2014)中公布的48对SSR引物构建27个水稻核心亲本指纹图谱，并获得所有亲本的SSR分子身份证号。48对SSR引物在27个亲本中共扩增到162个多态性片段，平均每对引物可检测到3.53个等位基因。能扩增到2个以上等位基因的SSR引物共45对，PIC值变化范围0.07～0.80，平均0.46。聚类分析结果表明，27个亲本的遗传相似性系数在0.593～0.944之间，基本上反映了不同材料间的亲缘关系。核心亲本SSR分子身份证的确定，不仅为品种鉴定提供了一个平台和标尺，便于建立品种的遗传指纹档案，还为保护品种知识产权，鉴定品种真伪及纯度提供了可靠依据。

水稻；核心亲本；SSR标记；指纹图谱；分子身份证

水稻是我国的主要粮食作物之一。近年来，参加区试的水稻新品种每年呈递增趋势。传统的水稻新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)测试因鉴定周期长、鉴定结果易受环境影响等原因，已不能满足现代新品种快速选育及推广的要求。基于重复基元重复次数变化的等位位点多态性，赋予了SSR标记能较好反应品种间遗传多样性的特点，使其能用于品种鉴定的研究。庄杰云等[1]利用24个SSR标记构建了103个水稻主栽品种的分子指纹图谱数据库，并对数据库中各个标记、各组材料表现进行分析，剔除了1个假杂交稻。McCouch等[2]利用6个SSR标记鉴别了71个相似水稻品种。目前国际新品种保护联盟(UPOV)已将SSR标记用于新品种的DUS测试中。我国农业部亦出台了相应方法标准[3]用于水稻品种鉴定。但随着育种进程的发展，少量亲本的延续使用，新品种间的遗传差异越来越小，品种间相似性逐渐增加。为满足新品种鉴定和市场监管的需要，农业部新制定了《NY/T 1433-2014 水稻品种真实性鉴定方法》[4]作为水稻新品种鉴定的标准。该方法在SSR标记数目、检测方法等方面进行了修改、补充。

利用SSR标记构建的指纹图谱，不仅可应用于品种保护，还可用于品种真实性及纯度鉴定。彭锁堂等[5]利用SSR标记RM17检测杂交水稻‘汕优63’和‘两优培九’种子，纯度分别为96.0%和98.0%，与田间测定结果96.2%和97.7%接近。同时，通过计算亲本间遗传距离，利用UPGMA法进行聚类分析，可明确各品种间的遗传差异，对科学配制杂交组合、预测杂种优势、提高抗病虫高产的育种效率等具有指导作用。陈跃进等[6]利用55个SSR标记研究23个品种的亲缘关系，采用UPGMA构建系统树和计算遗传距离，结果表明，23个品种分为籼型、粳型、偏籼型、偏粳型等4类。其中，偏籼型品种之间和偏粳型品种之间的亲缘关系均较远，选用他们作为亲本，可提高杂种优势。因此，建立一套水稻品种的标准指纹图谱数据库，对于假种鉴别、保护育种的知识产权与育种者的权益意义重大。

本研究利用NY/T 1433-2014所推荐的48对SSR标记物，构建27个水稻核心亲本的分子指纹图谱，并在此基础上对品种间的遗传相似性进行分析，从分子水平上为水稻育种、品种鉴定以及种子生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用27个水稻核心亲本包括：H032、R1128、R19、R2010、R608、华占、R299、R012、R1341、R571、R130、黄华占、R248、R9595、R199、R2469、R1102、R527、R0293、R812、R116、R1813、R618、R534、黄莉占、R4024、H472，均由湖南隆平种业有限公司提供。亲本分别在三亚、长沙种植，经严格去杂后收获。为保证供试材料的真实性和纯度，种子纯度严格按照国家标准GB4404.1[7]的规定检测，种子分样和保存按照GB/T3543.2[8]的规定进行。

1.2 DNA提取

水稻种子不少于30粒，催芽3～4 d后，取胚芽，按CTAB法[9]混合提取DNA，并溶解于200 μL 0.1×TE中，储于-20℃冰箱中。

1.3 DNA定量及PCR扩增

利用NaroDrop 2000 DNA微量检测仪将DNA浓度调整至50 ng/μL，用于PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：模板DNA2.0 μL，25 mmol/L buffer 2.0 μL，10 pmol/μL引物2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP1.6 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2 μL，双蒸水12.2 μL。反应在ABI 9700 PCR仪上进行。PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32个循环；72℃再延伸7 min；最后10℃保存。扩增产物于4℃冰箱保存备用。

1.4 扩增产物电泳及检测

在每管PCR扩增产物中加入4 μL上样缓冲液，充分混匀，于3000 rpm瞬时离心。用10 μL八道排枪取2.0 μL PCR产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(200 V，60 min)。电泳结束后，取出凝胶，于0.1% AgNO3溶液并轻摇银染8～10 min。之后用蒸馏水漂洗1次(20 s)；再将凝胶置于显影液(15.0 g/L NaOH，0.4%甲醛溶液)中，待凝胶适度着色后，取出凝胶，在凝胶成像系统的白光灯下拍照并记载位点。

1.5 SSR引物

本研究所用SSR引物，为国家行标NY/T 1433-2014所推荐，用于水稻品种真实性鉴定的4组、共48对引物(表1)。

1.6 指纹图谱构建

按1.4的方法，得到48对SSR引物对27个水稻亲本的电泳图谱。SSR引物按其先分组(共4组)，后按染色体号由小到大顺序排列(表1)，组成构建指纹图谱的SSR引物组合。27个水稻亲本按表1中顺序排列，每个水稻亲本在48对SSR引物上的图谱组合，便构成这些品种的特异SSR指纹图谱。

1.7 亲本SSR指纹图谱身份证号

对任意一对SSR引物得到的指纹图谱条带，根据其分子量大小对所有复等位位点从大到小依次进行阿拉伯数字编号。按1.6方法中亲本、引物的排列左右顺序，获得27个水稻亲本在48对引物中的等位位点对应具体数值。每个亲本在48对引物上的等位位点数值组合便组成其SSR指纹图谱身份证号。对于含两个带型的以分数形式表示，但只占一个数位。指纹图谱身份证号48位制固定不变，每个数位代表的SSR引物位置固定不变。

1.8 数据统计与分析

SSR扩增产物以“0”、“1”统计带型，亲本对应PCR产物在电泳图中有条带出现赋值为“1”，无条带出现赋值为“0”；缺失赋值为“9”，以此方法建成Excel数据表。每2份亲本间的遗传差异按Nei等[10]的方法求算遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD)：

GS=2Mxy/(Mx+My)

GD=1-GS

式中：Mx和My分别为x和y两亲本的总片段数，Mxy为两材料的公共片段数。

根据所得遗传相似系数，用非加权平均数UPGMA方法(unweighted pair group method using arithmetic averages)进行遗传相似性聚类。以上运算通过NTSYS-pc Version 2.10软件[11]进行(软件中参数为DICE)。

根据Smith等[12]报道的方法计算每1对SSR引物的多态性信息含量指数(polymorphic information content，简称PIC值)：

式中：fi表示第i种等位基因(alleles)的频率。

以上运算通过生物学软件POPGENE 1.31进行。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性及品种鉴别

48对引物在27个亲本中共扩增到162个多态性片段，第I、II、III、IV组标记各获得49、41、37、35个多态片段。除RM85、RM423及RM567在27个亲本中仅检测到1个片段外，其他标记均可扩增到2个及2个以上等位基因，平均每对引物可检测到3.53个等位基因(表1)。45个SSR位点的PIC值变化范围0.07～0.80，平均为0.46。等位基因数超过平均值的标记有17个；PIC值超过平均值的标记有25个。在两类大于平均值的指数中，共同出现的引物有15对，分别为RM583、RM71、RM336、RM311、RM209、RM208、RM232、RM258、RM224、RM493、RM21、RM424、RM289、RM332和RM7102。这些引物的等位基因数越多，PIC值越高，区分品种能力也越强。图1为引物RM7102对27个亲本材料的扩增结果。

在162个等位基因中，有28个只存在1个品种，其中涉及到19对引物及14个水稻亲本(表2)。这些特异等位位点的特征谱带将有助于识别和鉴定相应水稻品种。

表1 27份杂交水稻核心亲本SSR指纹标记等位基因数及多态性信息指数(PIC值)Table 1 The allele number and PIC of 27 hybrid rice core parental lines based on SSR fingerinting markers

表2 杂交水稻核心亲本特征性标记Table 2 Characteristic markers of hybrid rice core parent lines

2.2 SSR指纹图谱构建

利用48对引物，依次对27个水稻亲本材料基因组DNA(按顺序排列)进行PCR扩增，经显影、拍照，得到一套SSR引物的图谱(图1)。根据所构建的指纹图谱，可对某一品种的真实性进行鉴定。

图1 RM7102对27个杂交水稻核心亲本的扩增结果Fig.1 Amplification profile of 27 hybrid rice core parental lines at RM7102

2.3 SSR指纹身份证系统数据库构建

利用得到的Excel数据，构建SSR指纹身份证数据库。27个水稻亲本材料的SSR指纹身份证号见表3。由表3可见，6对引物检测到了杂合位点，分别为RM209、OSR28、RM590、RM571、RM316和RM7102。

表3 27个杂交水稻核心亲本的SSR指纹身份证号Table 3 The SSR Molecular identity cards of 27 hybrid rice core parent lines

(续表3)

以SSR标记遗传相似系数为原始数据，用UPGMA法对所有供试亲本材料进行聚类分析，并绘制成树状图(图2)。根据树状图，可直观地了解亲本间的亲缘关系远近。以相似系数0.667为阈值，R4024为单独类群，与其他26个亲本差异最大；以相似系数0.704为阈值，可将26个亲本分为两个亚群：第一亚群包含H032和R1128，第二亚群包含其余24个亲本。第二亚群在相似系数0.710阈值处又可分为2个亚群，A亚群的亲本携带蜀恢527、明恢63等血缘；B亚群亲本的遗传相似性反映了不同地理纬度的关系。

图2 27个水稻核心亲本UPGMA聚类分析图Fig.2 UPGMA clustering for 27 rice core parent lines

3 讨论

随着近年来水稻新品种的逐渐增多，多数品种遗传基础不断变窄，对于品种一致性、稳定性鉴定方法，需要不断完善。我国制定的《NY/T 1433-2014 水稻品种真实性鉴定方法》，不仅增加了检测标记的数量，还对检测方法、检测流程作了详细的规范，为新《种子法》在种质特异性、一致性、稳定性及品种审定、种子安全生产经营等方面提供了依据。

为确保研究结果与国家标准的一致性，本研究以国标规定的水稻品种真实性鉴定方法中要求的48对引物，对27个亲本进行了DNA指纹分析。首先，在特异性中发现，RM85、RM423及RM567在27个亲本中间无多态；RM17、RM219等标记的等位位点数及PIC值远低于平均值。这说明，27个亲本品种间有较高的平均遗传相似系数，但亲缘关系很近。这与前人认为我国当前水稻品种遗传基础较狭窄的结果一致[14，15]。其次，本研究中所用SSR标记具有代表性。一方面，聚类分群的结果与传统系谱对水稻的划分情况基本一致；另一方面，本研究中检测到的等位基因数和PIC值超过平均值的标记15个，等位基因数和PIC值均低于相关平均值的标记。在其他来源品种的研究中，等位基因数和PIC值均都较高，如黄瑞等[16]在构建非洲水稻种质资源SSR指纹图谱时，RM85、RM17、RM219的等位基因数分别为4、5、9，PIC值分别为0.463、0.658和0.823。这说明本研究所采用的指纹标记本身具有较高的代表性，由这些标记所构建的分子指纹图谱在品种鉴定、品种选育及种子管理等方面具有现实意义。

DNA分子指纹图谱以可见的谱带形式来表示各品种DNA的组成。通过对谱带进行条带赋值，构建品种指纹图谱数据和分子身份证库，可实现计算机管理。判断新选育组合是否是水稻新品种，只需将其指纹信息或分子身份证输入数据库，与现有品种进行比较，可达到鉴定目的。本研究已构建了27个亲本的分子身份证数据库，随着后期研究深入，已构建的数据库会有一定的局限性。这就需要继续往数据库中添加品种及其SSR指纹身份证号，进一步丰富和完善数据库。

对育种家而言，了解品种亲缘关系的远近是育种工作的基础。根据指纹图谱中所计算的品种间遗传距离，经UPGMA法所构建的品种间亲缘关系树状图，可直观地看出各品种间的遗传差异。根据Xiao等[17]和赵庆勇等[18]的研究结果，聚类分析结果能较好地预测亚种内的杂种优势，而亚种间的相关程度不足以预测产量杂种优势。本研究所选用的亲本均为籼稻品种，指纹图谱及聚类分析结果对于科学配制杂交组合、预测杂种优势具有一定指导作用，并为下一步的分子设计育种打下基础。

种子混杂、外来花粉授粉造成种质资源的变异及遗传漂变造成的改变是导致亲本不纯的主要因素。为长期保存种质资源，可利用SSR标记来有效鉴定各亲本材料，以确保保存材料的真实性。本研究中还检测到14个亲本具有特征性标记，在进行入库前的真实性和纯度检测时，可优先选用这些标记。

研究中，笔者还发现了7个标记杂合位点，这说明亲本可能不完全纯合。根据前人的研究报道[1]，这些杂合位点可能引起剩余遗传效应，导致杂交稻与其亲本不匹配，品种不稳定遗传等情况。田大刚等[19]认为，这种不稳定遗传的情况是广泛存在的。对于本研究中遗传不稳定的标记，在品种一致性、稳定性及杂种纯度检测的研究中，尽量不选择使用；在品种选育过程中，需紧密结合大田选育，以获得具有目标性状、稳定遗传的新种质/材料。

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Fingerprinting Construction of Rice Core Parental Lines with SSR Markers

ZENG Xiaoshan，PENG Dan，SHI Yuanyuan，XIE Wei，LIU Aiming*

(Yuanlongping High-Tech Agriculture CO.LTD.，Changsha，Hunan 410006，China)

Fingerprinting profiles and molecular identity cards of 27 rice core parental lines were established using 48 SSR markers recommended by “Sector Standard of Agriculture (NY/T 1433-2014)”.Total 162 Polymorphic fragments were detected with an average of 3.53 alleles for each SSR primer.Each of the 45 SSR primers are amplified more than 2 alleles respectively，theirPIC(polymeric index content) values ranged from 0.07 to 0.80，and the average PIC value is 0.46.Result from cluster analysis showed that genetics similarities among the 27 lines ranged from 0.593 to 0.944，which reflected basically the genetic relatives based on the pedigree analysis.Varietal genetic files were developed based on the established fingerprinting profiles and molecular identity cards，and found that it performed well in intellectual property rights protection，varietal identification and purity testing.

rice；core parental lines；SSR markers；fingerprinting；molecular identity cards

2016-04-20

曾晓珊(1977-)，女，副研究员，博士，主要研究方向为分子辅助育种，mail：zengxiaoshan@lpht.com.cn。*通信作者：刘爱民，Email：lam@lpht.com.cn。

公益性行业(农业)科技专项(201303005)。

S511.032

A

1001-5280(2016)05-0481-06

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.01