代森锰锌类农药对生姜种植地土壤酶活性及微生物群落结构的影响

2016-12-19李霞张小平喻晓张丹李战鲁刘子明王镧李欣

生态环境学报 2016年9期

李霞，张小平，喻晓，张丹，李战鲁，刘子明，王镧，李欣

1. 中国科学院水利部成都山地灾害与环境研究所，四川成都 610041；2. 四川省烟草公司广元分公司，四川广元 628000；3. 成都德通环境工程有限公司，四川成都 610041；4. 中国科学院近代物理研究所，甘肃兰州 730000

李霞1，张小平1，喻晓2，张丹1，李战鲁1，刘子明1，王镧3，李欣4*

研究了代森锰锌类农药克菌宝（15%）、深蓝（60%）和活根菌灭（80%）对生姜（Zingiber Officinale Roscoe）种植地土壤酶（脲酶、脱氢酶、磷酸酶和蛋白酶）活性和土壤微生物群落结构的影响，以期为评价代森锰锌的合理使用及环境修复提供一定的理论参考依据。结果表明，施用克菌宝的农田土壤在生姜旺盛生长期酸性磷酸酶活性提高了2.3%；深蓝能显著抑制旺盛生长期土壤酸性磷酸酶和蛋白酶活性（P＜0.05），抑制率分别为24.2%和40.0%，但这两种酶的活性在生姜收获期均有所恢复；活根菌灭在收获期可显著降低土壤酸性磷酸酶和脲酶活性（P＜0.05），土壤酶活性的抑制率与一定范围内（0.96 gm-2）的农药施用量呈正相关，但当施用量超过一定阈值（0.72 gm-2）后抑制率降低。3种农药对土壤酶活性抑制作用的强弱顺序为深蓝＞活根菌灭＞克菌宝；DGGE图谱的土壤微生物丰富度和Shannon-Wiener指数分析结果表明，土壤微生物的丰富度和多样性高低顺序为克菌宝＞深蓝＞活根菌灭，这与相应农药的土壤酶活性高低情况不一致，说明土壤细菌群落结构与土壤酶活性不是单一的线性关系。细菌16S rRNA基因的聚类分析表明细菌群落结构受到农药的影响，并与其施用量呈正相关。

代森锰锌；土壤酶；微生物群落和结构

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，它在促进植物生长、凋落物降解、生态系统生物地球化学循环、污染物质的降解等方面具有重要作用（Balser et al.，2002；Cavigelli et al.，2000；Kuzyakov et al.，2013）。土壤微生物以群落整体的形式参与土壤生命活动，其群落生物活性及群落结构的变化能敏感地反映土壤的质量、健康状况和生态系统的变化（滕应等，2004；姚斌等，2000）。土壤酶催化的土壤生物化学反应直接参与土壤系统中许多重要代谢过程（王理德等，2016），也在一定程度上灵敏地反映了土壤的环境状况（García-Ruiz et al.，2008；唐美珍等，2010）。

代森锰锌作为常用杀菌剂，其主要代谢产物是乙撑硫脲（ETU），ETU具有致癌性、致突变性和致畸性（Graham et al.，1973），欧洲将ETU的最大残留量定为0.05 mgkg-1（马山山等，2014）。国内外对代森类药物包括代森联、代森锰锌和代森锰等，在蔬果及土壤中的残留和降解情况已有较多报道，但多侧重于对其残留水平的调研（马山山等，2014；Caldas et al.，2004；Femandez et al.，2012；秦曙等，2014），仅有少量关于代森类农药与土壤酶活性关系的研究（侯利园等，2010；Guven et al.，2003），代森类农药与土壤微生物群落之间的研究也很有限。已有的研究发现，低用量（0.5 mgkg-1）代森猛锌可促进土壤细菌、真菌和放线菌的增殖，使土壤呼吸作用增强；而高用量代森锰锌则抑制细菌、真菌和放线菌的增殖（唐美珍等，2010），土壤微生物及其活动受到代森锰锌的潜在威胁（Černohlávková et al.，2009）。但目前尚未见代森锰锌与土壤酶活性和微生物群落结构之间关系的研究报道。本文研究了施用3种代森锰锌类农药对生姜（Zingiber Officinale Roscoe）旺盛生长期（VGS）和收获期（HS）农田土壤酶（脲酶、磷酸酶、脱氢酶和蛋白酶）及土壤微生物群落结构的影响，并分析了土壤酶活性和土壤微生物结构之间的内在关系，旨在为评价代森锰锌的合理使用及环境修复提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于四川省乐山市犍为县芭沟镇，北纬29º15′、东经103º45′，海拔532 m，为坪状、低山峡谷地貌，土壤为三迭纪须家河组碳坝泥土，中上肥力，排灌条件好，地势平坦。年均温 17.5 ℃，月均温7.6 ℃。最热月为7—8月份，均温26 ℃左右；最冷月为1月，极端最低气温0 ℃。无霜期达333 d，年均降水量1199～1200 mm。试验地土壤基本性质见表1。

1.2 农药

3种农药均购于四川省农业高新技术产品市场，分别为深篮（青岛润生农化有限公司，其有效成分为60%的代森锌可湿性粉剂）、克菌宝（新加坡利农私人有限公司，其有效成分为30%王铜与 15%代森锌混剂）、活根菌灭（山东荣邦化工有限公司，其有效成分为80%的代森锰锌可湿性粉剂）。

1.3 试验设计

在生姜种植地农田上设置4个处理（农药施用量为生产厂家推荐用量），分别为：（1）施用深篮（代森锰锌喷洒量为0.72 gm-2）；（2）施用克菌宝（代森锰锌喷洒量为0.48 gm-2）；（3）施用活根菌灭（代森锰锌喷洒量为0.96 gm-2）；（4）对照（喷洒清水）。每个处理3次重复，共12个小区，完全随机区组排列。小区面积4 m×12 m，小区间隔30 cm，小区周围挖40 cm深沟。在生姜旺盛生长期（2006年8月6日）施用农药，以后每10天喷洒1次，共喷施3次。

1.4 土壤样品的采集

采样时间分别为生姜旺盛生长期（2006年8月26日）和收获期（2006年11月17日）。每个土壤样方采用5点取样法，钻取深度为20 cm的土壤过2 mm筛，剔除石砾和植物残根等杂物，每个土样分为3份，分别装入聚乙烯袋中，立刻带回实验室，1份风干保存于室温，另外2份分别保存于4 ℃和-18 ℃条件下。

1.5 实验方法

1.5.1 土壤理化性质和酶活性的测定

土壤酶活性的测定参照土壤学报（关松荫等，1984）；土壤养分指标测定参照土壤农化分析手册（劳家柽，1998）。

1.5.2 土壤处理及DNA提取

采用化学裂解法（Zhou et al.，1996）直接从土壤中提取土壤样品的基因组DNA，土壤样品的细菌基因组DNA大小均为2.2 kbp左右。采用上海生工的玻璃珠DNA胶回收试剂盒（产品号：SK111），按照操作说明对DNA粗提液进行纯化。

1.5.3 引物及细菌16S rRNA片段的PCR扩增

16S rRNA 基因 V3区扩增使用 Applied Biosystem的Gene Amp PCR system 2700型基因扩增仪，将纯化得到的4种土壤的基因组DNA作为聚合酶链反应（PCR）的模板，利用对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物F357GC（5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG A GGCA G CA G-3′）和R518（5′-A TT ACC GCG GCT GCT GG-3′）进行PCR扩增，扩增产物片段长约230 bp。扩增采用100 μL反应体系：其中包含100 ng的模板、30 pmol每种引物、200 μmolL-1dNTPs（每种dNTP10 mmolL-1）、10 μL的10×PCR buffer（无MgCl2）、1.5 mmolL-1的MgCl2、5 U的Taq DNA聚合酶和适量的双蒸水补足100 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环后，最后在72 ℃下延伸8 min。PCR反应的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.4 扩增产物的DGGE分析

变性梯度凝胶电泳（DGGE）使用DcodeTMGene系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。采用80 gL-1聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为：30%～60%，电泳条件为：0.5×TAE，60 ℃、150 V下电泳8 h。电泳结束后用1∶10000 SYBR Gold（Bio Probe Products，Rockland，ME，USA）染色30 min，立即用YLN-2000凝胶影像分析系统（北京亚力恩机电技术研究所）成像和拍照，获得DGGE图谱。

表1 试验地土壤基本性质Table 1 Basic properties of experimental area

1.6 结果数据分析1.6.1 土壤酶活性数据分析

采用Excel软件及SPSS 17.0软件进行ANOVA方差分析和多重比较（LSD，P≤0.05）。

1.6.2 酶活性抑制率的计算公式为：

抑制率=(A-B)/A×100% （1）

式中，A为没有施用农药处理的土壤酶活性，B为施用农药处理的土壤酶活性。

1.6.3 土壤总体酶活性指标Et：

其中，Xi为第i种土壤酶活性，为第i种酶活性的平均值。

1.6.4 DGGE图谱分析

采用Quantity One软件分析DGGE图谱各农药污染土壤的微生物群落结构的多样性和相似性。相似性指数直接由软件算出，构建聚类图；利用DGGE图谱分析不同取样点微生物群落的多样性，以Shannon-Wiener多样性指数（Shannon-Wiener diversity index，H′）来表示：

式中，Pi为第i个物种在全部样品中的比例，Pi=ni/N，ni为第i个条带的多度，N为所有条带的总多度。

2 结果与分析

2.1 3种农药对土壤酶的影响

由表2可知，施用克菌宝（代森锰锌施用量为0.48 gm-2）后土壤酶活性在旺盛生长期与对照差异虽不显著，但脲酶、过氧化氢酶和蛋白酶活性都存在不同程度降低，可能是因为微生物细胞膜蛋白质与磷脂间稳定的极性键或疏水性键受到农药的胁迫而被解离，影响了细胞壁分泌酶类的释放，使得酶活性降低（王黎明等，2004）；酸性磷酸酶活性提高了2.3%，这可能是因为土壤微生物受到克菌宝的胁迫而应激释放出的物质及胞内酶有利于酸性磷酸酶活性的提高，傅丽君等（2007）也报道了甲基托布津、代森锰锌、杀灭菊酯、阿维菌素等农药施用使枇杷园土壤磷酸酶活性受到了一定程度的促进，农药中的乳化剂、溶剂和农药本身也可作为微生物的碳源或能源而促进酶的分泌（王黎明等，2004）。收获期脲酶活性显著降低（P＜0.05），说明脲酶对克菌宝（代森锰锌施用量为0.48 gm-2）更加敏感，周海波等发现低浓度的代森锰锌能够提高脲酶和过氧化氢酶活性（周海波等，2012），侯利园等（2010）也认为代森锰锌的施用对土壤脲酶有促进作用，但本研究未发现脲酶和过氧化氢酶活性提高，推测与试验所采用的土壤性质差异有关（傅丽君等，2007）。

与对照相比，施用深蓝（代森锰锌施用量为0.72 gm-2）后土壤酸性磷酸酶和蛋白酶活性在收获期显著降低（P＜0.05），抑制率分别为24.2%和40.0%（图1），而收获期这两种酶活性均有所恢复，这种先抑制后恢复的趋势，与已有报道一致（傅丽君等，2007），这可能是因为农药进入土壤后会对土壤动物、微生物和植物根系产生一定的毒害作用，而随着时间的推移，在好气及厌气条件下，代森联在土壤中的残留量逐渐降低（马山山等，2014），农药及其有毒代谢产物开始降解，土壤微生物的适应性逐渐增强，土壤酶活性得以逐渐恢复（赵志强等，2010）。土壤脲酶和过氧化氢酶的活性在收获期显著降低（P＜0.05），表明高浓度代森锰锌对脲酶和过氧化氢酶有抑制作用，并且浓度越高，抑制作用越大（周海波等，2012）。张承东等（2001）报道土壤中施用苯噻草胺后，土壤酶的活性一直受到抑制，未见恢复，推测与土壤酶在施药量加大之后对污染物质的缓冲能力减弱，试验考察期区间内农药的降解不足有关；另外，施药量加大后土壤微生物数量减少、耐受性降低也不利于酶活性的恢复。

表2 农药对土壤酶活性的影响Table 2 Effect of pesticides on soil enzyme

图1 农药在VGS期（a）及HS期（b）对土壤酶活性的抑制率Fig. 1 The inhibition ratio of Pesticides on soil enzyme at vigorous growth stage (a) and harvested stage (b)

施用活根菌灭（代森锰锌施用量为0.96 gm-2）后土壤酸性磷酸酶和脲酶活性在收获期显著降低（表2）（P＜0.05），说明代森锰锌施用量越大，对土壤酶的抑制作用越大（周海波等，2012；张承东等，2001）。和文祥等（2006）研究发现2,4-D对土壤脲酶的影响存在浓度迟缓期，随后表现出较强的完全抑制作用。但本试验活根菌灭对土壤酶的抑制率总体低于深蓝（代森锰锌施用量为0.72 gm-2）而高于克菌宝（代森锰锌施用量0.48 gm-2），说明土壤酶活性与一定浓度范围内的农药施用量呈正相关，当农药施用量超过一定阈值后抑制作用减弱，此外，土壤酶之间的性质差异也会影响农药胁迫下土壤酶的耐受性、反馈速度和应对方式（杨志新等，2001；Rani et al.，2008；周世萍等，2005；Madhuri et al.，2002；Schaffer，1993；谢文军等，2006）。总体说来，对土壤酶活性抑制的强弱顺序为深蓝＞活根菌灭＞克菌宝（图1）。

由表2可知，土壤酶总体活性指标CK＞克菌宝＞活根菌灭＞深蓝，与土壤酶受到的抑制强弱一致（图1）。用土壤酶活性指标的优势在于消除了不同土样酶活性的量纲及大小的影响，且无量纲的最终参数便于比较，可较好地表征土壤中总体酶活性和肥力水平高低（和文祥等，2010）。土壤酶活性指标越大，说明土壤的总体酶活性和肥力水平越高。

2.2 土壤微生物的群落多样性分析

土壤微生物群落多样性能够表征土壤生态系统群落结构和稳定性，是最有潜力的敏感性生物指标之一（孙波等，1997），图2a是4个土样细菌16S rRNA的V3可变区扩增产物的DGGE电泳图。由图2a可知，4个土样经过变性梯度凝胶电泳分离，可得到数量不等、亮度不同的电泳条带。与对照相比，活根菌灭处理后的土壤细菌群落图谱条带减少最多，克菌宝与CK的条带数量最相似，其次为深蓝，说明土壤微生物的丰富度是克菌宝＞深蓝＞活根菌灭；Shannon-Wiener指数代表的土壤微生物多样性是克菌宝＞深蓝＞活根菌灭（表3）。

图2 土壤样品细菌16S rRNA的PCR产物DGGE电泳图（a）和样品间细菌的聚类图（b）Fig. 2 DGGE profiles of bacterial 16S r RNA (a) and clustering figure of bacteria in samples (b)

表3 农药污染土壤多样性分析Table 3 The effect of mancozeb on soil bacterial diversity

应用Quantity one软件定量分析细菌16S rRNA基因的DGGE图谱，泳道带型相似度越高，说明细菌群落结构越相似。由图 2b可知，克菌宝与对照的群落结构最相似，其次是深蓝和活根菌灭，农药对土壤微生物群落结构组成的影响活根菌灭＞深蓝＞克菌宝，细菌群落结构与农药的施用量呈正相关关系。

克菌宝对土壤微生物的数量和丰富度影响最小，而土壤酶的总体活性最高，可见微生物的数量和丰富度高与土壤酶活性正相关（高明华等，2016），而群落结构分析发现克菌宝对微生物群落结构组成的影响最大，说明土壤细菌群落结构与微生物的数量、丰富度和土壤酶的活性不是单一的线性关系，这是因为土壤酶除了来源于土壤微生物外，植物、土壤动物和其他进入土壤的有机物质也会对土壤酶的活性产生影响，谢学辉等（2012）研究也表明，不同重金属浓度对微生物多样性的影响不是简单的线性关系，因此，农药对土壤微生物及酶的影响还要综合考虑土壤的成分及外源的其他影响；就条带的亮度来说，以活根菌灭的条带亮度最低，而克菌宝在多个位置条带亮度有所增加，说明施用克菌宝对部分种类的细菌数量有激活作用，这可能与其成分中含有王铜有关（陈石等，2009），农药成分的配伍可能会增加原有微生物生存微环境的多样性，使种群间关系向有利于部分细菌种类生存的方向发展。

3 结论

总体来看，3种农药对土壤酶活性的抑制强弱顺序为深蓝＞活根菌灭＞克菌宝。土壤酶活性与一定浓度范围内的农药施用量呈正相关，当农药施用量超过一定阈值后抑制作用减弱。喷施克菌宝会激活土壤酸性磷酸酶活性，可能源于微生物应激分泌释放出的物质及胞内酶可增加磷酸酶活性。土壤酸性磷酸酶和蛋白酶脲酶活性对深蓝胁迫呈现出抑制-恢复的趋势，随着时间的推移，农药及其毒性代谢产物开始降解，土壤微生物的适应性逐渐增强，这些因素可使农药毒害作用逐渐消失，土壤酶活性得以逐渐恢复。

克菌宝对土壤微生物的数量和丰富度影响最小，而土壤酶的总体活性也最高，可见微生物的数量和丰富度高与土壤酶活性正相关。群落结构分析发现克菌宝对微生物群落结构组成的影响最大，表明土壤细菌群落结构与微生物的数量、丰富度和土壤酶的活性不是单一的线性关系。施用克菌宝使部分种类的细菌数量增加，与其成分中含有王铜有关。农药对土壤微生物群落结构组成的影响与农药的施用量呈正相关。

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Effect of Mancozeb on Soil Enzyme Activities and Microbial Community in Ginger Fields

LI Xia1, ZHANG Xiaoping1, YU Xiao2, ZHANG Dan1, LI Zhanlu1, LIU Zhiming1, WANG Lan2, LI Xin3*

1. Institute of Mountain Hazards and Environment, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China;
2. Chengdu De Tong Environmental Engineering Co., Ltd, Chengdu 610041, China; 3. Institute of Mordern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China

The effect of mancozeb on activity of soil enzyme (urease, dehydrogenase, phosphatase and protease) and the diversity of microbial community in ginger fields were investigated, with treating amount of 0.48, 0.72 and 0.96 gm-2mancozeb in soil. The results showed that acid phosphatase activity was increased by 2.3% after treated with 0.48 gm-2mancozeb in vigorous growth period (VGS); 0.72 gm-2mancozeb inhibited soil acid phosphatase and protease activity significantly in VGS (P＜0.05), with the inhibition rates 24.2% and 40.0% respectively, however, enzymes activities were partial recovered in ginger harvest season (HS). The activities of acid phosphatase and urease were markedly decreased in HS (P＜0.05) by treated with 0.96 gm-2of mancozeb, indicating that the inhibition rate is positive correlation with soil enzyme activity in certain range of treating amount (0.96 gm-2), inhibition rate weaked when the treatment amount exceeds certain range (0.72 gm-2). The inhibitory effects of mancozeb to soil enzyme follows a descending order in treatment amount: 0.72, 0.48, 0.96 gm-2. Soil microbial richness and shannon wiener index of the DGGE profile exhibited that 0.48 gm-2was the most influential treating amount, following with 0.72 gm-2and 0.96 gm-2, it is not a single linear relationship between bacterial community structure and soil enzyme activity. Cluster analysis demonstrated that the diversity of bacterial community is positively correlated with mancozeb treating amount.

mancozeb; soil enzyme; microbial community structure

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.09.022

S154.3

1674-5906（2016）09-1569-06

李霞, 张小平, 喻晓, 张丹, 李战鲁, 刘子明, 王镧, 李欣. 2016. 代森锰锌类农药对生姜种植地土壤酶活性及微生物群落结构的影响[J]. 生态环境学报, 25(9): 1569-1574.

LI Xia, ZHANG Xiaoping, YU Xiao, ZHANG Dan, LI Zhanlu, LIU Zhiming, WANG Lan, LI Xin. 2016. Effect of mancozeb on soil enzyme activities and microbial community in ginger fields [J]. Ecology and Environmental Sciences, 25(9): 1569-1574.

国家自然科学基金项目（41571315）；中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目（Y6K2200200）；中国科学院院地合作项目（Y406060YDO）

李霞（1982生）女，实验师，硕士，研究方向为环境微生物资源的开发与利用。E-mail: lixia@imde.ac.cn

*通信作者：李欣，男，副研究员，博士。E-mail: lexlll920@impcas.ac.cn

2016-08-11