农产品中多种农药残留系统检测方法的开发和推广

筱 禾 编译（上海市农药研究所，上海 200032）

农产品中多种农药残留系统检测方法的开发和推广

筱 禾 编译
（上海市农药研究所，上海 200032）

随着物流的发展，日本可以从世界各地进口各种食品。同时，根据《食品卫生法》（1947年第233号法案）规定的农药最大残留限量（MRLs），自2001年起冷冻蔬菜等进口食品中农残超标案例逐年增加。此外，2002年以来披露，诸如敌菌丹（captafol）和三环锡（cyhexatin）等日本国内未登记农药的进口和使用，按照《农用化学品管制法》（1948年第82号法案）该2个品种登记已过期。然而，对消费者来说，农产品中农药残留是关系食品安全的重中之重。为了禁止因滥用农药而造成的流通领域食品中农药残留超标，日本厚生劳动省（MHLW）于2006年5月29日根据《食品卫生法》中的农业化学品、饲料添加剂和兽药（下文只讨论农用化学品）残留物质的相关规定，推出了“肯定列表制度”（Positive List System）。约有800种物质以临时限量（provisional MRLs）的形式设置了MRLs，不具有MRLs的农用化学品则设置了统一限量（uniform limit）0.01 mg/L。

为了顺应“肯定列表制度”的要求，除了基于连接电子捕获检测器（ECD）、火焰光度检测器（FPD）和氮磷检测器（NPD）的气相色谱（GC）以及连接紫外检测器（UV）和荧光检测器（FLD）的高效液相色谱（HPLC）的单一和多残留检测方法，有必要建立农药多定量残留分析检测方法。一些食品安全事故的出现也拉响了食品安全警报，不仅仅是食品腐烂问题，还有来自农业、畜牧业、渔业产品的加工食品中意想不到的农药残留。因此，建立可快速鉴定且对各种食品中常用农药残留半定量分析的综合系统同样是必要的。

Eiji Ueno通过采用串联四极杆质谱法（MS/MS）结合各种样品中多种农药残留物质的有效提取方法、无农药损耗消除基质的有效净化方法以及可靠的多元分离和检测方法建立了一个系统化方法，在选定目标农药后对日本爱知县农药残留监测数据进行统计分析，以确定地检测并准确地量化农产品和加工食品中组成成分复杂的多种农药残留物。

Eiji Ueno概述了用于农产品和加工食品中多种农药残留检测的系统方法，重点介绍了符合日本厚生劳动省要求、可用于甲胺磷等农药的新型多残留定量检测方法和一个不使用农药标准品的GC-MS（/MS）综合色谱检测系统的开发。

1 多残留分析方法概述

1.1 目标农药选定

已经建立了可进行大批量各种农产品中多种农药残留的定量连续分析的系统方法。首先，每个统计年选定约200种目标农药进行成本效益监管监控。这些农药是日本或邻国作物保护中普遍采用的品种，和/或在过去5个统计年（如2001年3月至2006 年4月）在爱知县农产品监控中经常被检出的品种（占总调查结果98%以上）。因此，如果能够同时分析近200种目标农药，即可认为是覆盖了大部分的农药残留。

1.2 多残留系统分析方法的建立

选定目标农药之后，继续进行可避免误报、漏报及定量不准确问题的系统方法的开发。如图1所示，装有被连接到2个进样口的2类毛细管柱（5%苯基-甲基系列RXI-5Sil MS和三氟甲基系列的Rtx-200 MS）的电子电离（EI）-多反应监测模式（MRM）双柱GC-MS/MS同时配置离子源（图2），应用2类具有不同分离特性的核-壳色谱柱［十七烷基（C27）系列CAPCELL CORE AQ和五氟苯基系列（PFP）CAPCELL CORE PFP］的正/负离子切换电喷雾电离（ESI）-可编程MRM模式LC-MS/MS，被作为第一优先。图3为电喷雾电离-多反应监测扫描（ESI-MRM）模式LC-MS/MS分析农药残留示例。葡萄柚是柚和橙自然杂交产生，所以必须注意，LC条件时柚的测试溶液的色谱图中抑霉唑质子化分子产生的整体产物离子出现类似干扰峰。除了MS/MS系统，GC-MS EI-SIM/全扫描模式、GC-MS负化学电离（NCI）-SIM/全扫描模式、双柱GC ECD/ECD，双柱GC-FPD/NPD、配置二极管阵列检测器（DAD）的LC-MS ESI-SIM/全扫描模式和用于N-甲基氨基甲酸酯类农药残留分析的HPLC柱后FLD也适用。因此，建立了应用多元分离和检测系统的系统化方法。

图1 多元分离和检测系统

图2 双柱气相色谱-质谱［GC-MS（/MS）］系统（Agilent 7000三重四级杆GC-MS）

该系统化方法的有效应用，改善了费时的问题，减少了GC毛细管柱更换等故障维护的几率，克服了目标农药电离的抑制或促进作用，进而尽可能地减少色谱图中出现干扰峰，被认为是样品纯化和稀释必不可少的。因此，在官方多残留检测方法的基础上，Eiji Ueno参与了方法制订，进行了更为高效的提取和净化方法的开发。

为了提取溶解度和稳定性范围广泛的多种农药，必须使用亲水和非质子有机溶剂。与丙酮等相比，乙腈提取脂质的提取率较低，虽然低极性农药的溶解度略低，但已证实许多农药以试样量（如20 g）3倍量以上的乙腈（60 mL）制备匀浆即可确保足够的提取率。此外，样品萃取液通过盐析分离为乙腈层与水层。利用乙腈的特性，开发了简易的乙腈提取方法，此法使用具刻度筒形分液漏斗的吸滤系统，在中性或弱酸性条件下采用盐析，可精确地收集乙腈层的等分试样（图4）。

随后，为了防止固相萃取（SPE）柱穿透，并充分显示凝胶渗透色谱（GPC）柱的性能，使盐、糖和氨基酸等许多强极性杂质随水脱除，超声波脱水之后和用乙酸乙酯和无水硫酸钠再溶解法预净化，开发了结合GPC和微型柱SPE的自动净化系统。利用GPC去除脂质等大分子杂质。但含有叶绿素、类胡萝卜素及高级脂肪酸的馏分和含农药残留的馏分间的区分并不清晰。以GPC洗脱上述杂质的早期农药馏分经石墨碳-PSA（乙二胺-N-丙基甲硅烷基硅胶）-双层微型柱等SPE微型柱被选择性通过，此法能够有效去除这些杂质而不造成农药损失（图5）。此外，尽可能配置一个高灵敏度且稳定的设备建立色谱检测系统，作为测定一定稀释限度内的测试溶液的方法。

2 甲胺磷等农药多残留新颖分析方法

2.1 传统农药多残留分析方法存在的问题

日本厚生劳动省关注了利用GC-MS和LC-MS（/MS）进行农产品多残留分析的方法。该法总结如下：⑴ 用乙腈从样品中提取农药；⑵ 中性条件下盐析后，将提取物用无水硫酸钠脱水；⑶ 水果和蔬菜的提取物用石墨化碳（graphitized carbon）-氨基（氨基丙基甲硅烷基硅胶）2-层微型柱SPE净化；谷物、豆类、坚果和种子的提取物先用C18（十八烷基甲硅烷硅胶）微型柱SPE净化，随后用石墨化碳-氨基双层微型柱SPE净化；⑷ 用GC/MS或LC-MS（/MS）进行测定和确定。然而，不同农药的物理化学行为不同，某些农药在分析过程中必然有一部分随基质流失。例如，甲胺磷是一种水溶性农药［在水中的溶解度大于200 g/L，KOWlog P=-0.8 （20 ℃）］。在盐析步骤中，极性强的农药倾向于进入水层，在净化步骤中吸附于石墨化碳-氨基吸附剂上，由于GC的基质效应峰强度出现极值，之后这些峰趋于拖尾。另外，甲胺磷与常用C18LC柱的亲合力低，LC-MS（/MS）对其的灵敏度相对较低，基质并存时经常发现抑制或促进电离。因此，表明了定量性表述的一些问题。应当指出的是，在测定方法建立过程中，脂肪不溶解于乙腈，不能在动物和水产品脂肪组织之间进行有效分配，故而存在不能从样品中充分提取农药的可能性。从原理上来看，应以脂溶性的正己烷和丙酮等作为萃取剂。

图3 LC-MS/MS电喷雾电离-多反应监测扫描（ESI-MRM）模式检测农药残留示例

图4 使用筒形分液漏斗的吸滤系统

另一方面，动物和水产品农药多残留测定方法总结如下：⑴ 除牛奶、蛋类和蜂蜜等液体样品外，以丙酮-正己烷（1︰2）提取样品中的农药；⑵ 提取物用无水硫酸钠脱水后，GPC和PSA微型柱SPE净化；⑶ 用GC/MS或LC-MS（/MS）进行测定和确定。丙酮-正己烷（1︰2）对动物和水产品脂肪组织具有很强的溶解性。然而，本提取方法，弃去通过离心分离的水层，收集所得的有机层（主要是正己烷），适用于弱极性农药（KOWlog P＞1，如乐果）。由此表明，这个日本法定多残留分析方法并不适用于瘦肉等固体样品中的强极性农药。因此，应厚生劳动省的要求，Eiji Ueno等着手开发一种可精确地测定各种食品中众多农药的新型多残留分析方法。

2.2 新型农药多残留分析方法的建立

如上所述，一般认为乙腈无法充分提取脂肪类食品中的某些农药残留。因此，在动物和渔业产品法定多残留检测方法的基础上开发了一个可靠的多残留检测方法。为了稳定有效地提取包括水溶性农药在内的许多农药（KOWlog P＞1，如乐果），如图6所示，将样品用乙酸水溶液制备匀浆，以丙酮-正己烷（2︰3）提取，于弱酸性条件下熔化脂肪组织，然后离心。将包括水层的上清液合并过滤，浓缩合并滤液后，将NaCl饱和残留物水溶液上样于大孔硅藻土柱，用乙酸乙酯洗脱。共同提取物（co-extractives）经GPC自动净化（图7），然后再过SAX/PSA双层微型柱SPE。将净化后的样品提取物进行GC-MS（/MS）和LC-MS/MS分析。

图5 GPC（GL Sciences G-Prep GPC 8100）后的石墨化碳/PSA二层叠式SPE净化系统

糖（KOWlog P=−5～−2）和氨基酸（KOWlog P=−5～−1，取决于pH值）等大多数水溶性杂质可过装有大孔硅藻土柱的液-液分配色谱柱，用水有效洗脱。磷脂和甘油等大多数脂质可过填充苯乙烯二乙烯基苯共聚物柱（12 mm i.d. ×16 μm）GPC（图7）有效洗脱，还缩短了制备时间，溶剂的用量也显著减少。试验证明受有机酸等杂质的影响，部分脂肪酸过PSA微型柱会被洗脱，故该法采用填充强阴离子交换系列SAX（三甲丙基甲硅烷基硅胶）和PSA的双层微型柱。在新型多残留检测方法开发过程中，不易堵塞的大孔硅藻土柱（GL Sciences InertSep K-solute），GPC/SPE净化系统（GL Sciences G-Prep GPC 8050和8100），SAX/PSA的双层微型柱（GL Sciences InertSep SAX/PS）和GPC柱（Shodex CLNpak EV2000 12F和CLNpak EV-G 12C）已投放市场。

已按照2012年日本厚生劳动省制定的《日本食品中农业化学品残留指南》对新的多残留检测方法进行了验证，2015年2月26日作为日本官方农药多残留LC-MS II（动物和水产品）检测方法（图6）。

3 GC-MS半定量综合系统

为了处理紧急事件，也需要有可用于大多数农药包括非预期的农药的快速鉴定和半定量综合系统。因此，Eiji Ueno等评估了GC-MS EI扫描模式联用相对保留时间、质谱和校准曲线3种数据库的检测农药等环境污染物的同步测定方法，并报道了方法的有效性。也就是说，常规校准曲线数据库以氘化稳定的萘-d8、菲-d10和荧蒽-d10等多环芳香烃作为内标，根据相对保留时间分配。一般认为，常规数据库可用于筛选相对稳定的环境污染物，但不适用于检测具有各种物理化学行为的农药，如不稳定的农药会在GC进样口分解，由于基质效应，回收率出现极值，比如大于200%（图8-A）。

图6 日本官方农药多残留LC-MS II（动物和水产品）检测方法基础流程图

图7 填充苯乙烯二乙烯基苯共聚物（Shodex CLNpak EV2000柱: 12 mm i.d.×300 mm×6 μm, CLNpak EV-G gard柱: 12 mm i.d.×100 mm×16 μm, 流动相：丙酮-环己烷（3 : 17）,流速：3 mL/min）的GPC柱净化

图8 两类校准曲线数据库定量精度的差异

因此，为了提高校准曲线数据库的精度和可重复性，选择乙酰甲胺磷-d6、西维因-d7、毒死蜱-d10、抑霉唑-d5、马拉硫磷-d10和es-氰戊菊酯-d7等19个以上稳定同位素标记的农药［替代物（surrogates）］作为GC-MS分析的合适内标，此成本低廉且能稳定供给的替代物混合物已商品化。Eiji Ueno等发明的“色谱法多定量分析”技术，可根据经试验获得的物理化学性质数据，将这些替代物精准地分配至数以百计的农药（图8-B）。顺便提一下，4,4-滴滴涕-d8（p,p'-DDT-d8）和α-六六六-d6（α-HCH-d6）等受《日本化学物质审查法》（1973年第117号法案）严格监管，没有从现有替代物中选择。

最后，2013年11月宣布推出不使用农药标准品的GC-MS综合色谱检测系统。该系统使用EI-SIM/扫描切换模式GC-MS，双柱确证命名为岛津Twin Line MS系统（图2），半定量数据库命名为岛津Quick DB。Quick DB数据库包括450多种农药替代物创建的保留指数、质谱和校准曲线。考虑检测频率和灵敏度的同时，约160种多类优先农药（priority pesticides）选择SIM模式，添加农药（additional pesticides）选择扫描模式，同时根据上述技术将19种替代物分配至这些农药。该系统适用于奶酪、黄油和味噌（日本传统的调味料，由发酵大豆生成）等高脂肪食品日常分析使用。一些食品的色谱图中出现了相当多的干扰峰，在某些情况下，无法利用替代目标离子色谱（SIM离子）消除这些干扰峰。为了解决这一难题，GC-MS配置了2个不同的色谱柱。因此，由于干扰和/或保留时间而不能被第一个色谱检测出农药被转到后方，受基质影响可由第二色谱检测和定量。当意识到有基质存在时，扫描模式有助于确认化合物特性。这个新系统具有快速鉴定和半定量检测各种食品中多种ppb级（如0.01 mg/kg）农药残留的性能，符合日本“肯定列表制度”的要求。

最近，因为应用MRM模式的高选择性导致检出限较低，GC-MS/MS已被普遍用于农药残留分析。GC-MS/MS EI-MRM模式的岛津Quick DB也同时商品化。

4 结 论

在日本，随着“肯定列表制度”的推行和最新MS（/MS）性能的改进，GC-MS（/MS）和LC-MS/MS已成为分离和检测设备的首选。尤其是MS/MS能够选择性地获得MRM色谱图和产物离子扫描光谱，因此或可简化样品的制备方法。但在电离过程中，一些基质对MS（/MS）具有很大的影响。最新选择性检测GC和HPLC的性能也有所改善。因此，当需要精确定量时，必要时应将样品适当净化后再由GC 和HPLC确认。突发的食品安全事故不仅是对进口食品的示警，同样也是对日本国内食品安全的示警。结合上述全面色谱检测方法的MS（/MS）系统不仅在紧急事件中有望使用，也可在农产品中农药残留的监管监控及各种食品装运前的检验中使用。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.02.06

TQ450

A

1009-6485（2016）02-021-05

筱禾，女，硕士，工程师，Tel: 021-64387891-201。

2016-03-30。