人参黑斑病拮抗菌的筛选1)

张雷鸣 徐娇 刘振鹏 任伟超 马伟

(北安市第一人民医院，北安，164000) (黑龙江中医药大学)



人参黑斑病拮抗菌的筛选1)

张雷鸣 徐娇 刘振鹏 任伟超 马伟

(北安市第一人民医院，北安，164000) (黑龙江中医药大学)

通过与人参黑斑病(AlternariapanaxWhetz)病原真菌对峙培养的方法，从由人参叶片分离得到的18种内生真菌中，筛选出Ab2.2①、AY10-1①、AXY②3种人参黑斑病拮抗菌，其抑菌率分别为70.9%、75.6%、77.5%，2种毛壳属(ChaetomiumKunze)真菌As①、As②的抑菌率分别为56.4%、62.4%。

人参；内生真菌；生物防治；人参黑斑病；人参病害

Biocontrol fungi against ginseng black spot pathogen were selected from 18 stains of endophytic fungi isolated from ginseng leaves by using plate-confrontation method. Ab2.2①, AY10-1① and AXY② bacteriostasis rates were 70.9%, 75.6%, and 77.5% respectively, and the rates of theChaetomiumfungi As①, and As② were 56.4%, and 62.4%, respectively.

人参黑斑病属于传染较为严重的病害，发病率一般在30%左右，严重的可达70%以上，影响人参参根的产量以及种子的收获，造成减产和参籽干瘪，是我国东北及河北等地，流行性很高的一种病害。在参龄达到3年以上的参场，也均可受到较为严重的侵害[1]。对于人参黑斑病的微生物防治近年来研究者较多，以吉林农业大学的研究者为众。但目前的研究仅停留于试验研究阶段，未见微生物及微生物源农药在人参黑斑病实际生产中得以应用的报道。微生物的选择来源于人参内生菌、根际土壤微生物及其它微生物。李勇等[2]从人参根中分离内生细菌，得到2株对于人参黑斑病有明显抑制作用的菌种，且对人参菌核病和锈腐病同样有明显作用，可作为生防菌进一步研究。贾斌等[3]从人参等多种中药材根茎叶中，分离对于人参黑斑病具有拮抗作用的内生细菌，发现从人参根中的得到的拮抗菌株最多，其中的1株解淀粉芽孢杆菌细菌，对于人参黑斑病的抑菌率为80%，抑菌作用明显。李鹏翔[4]采集人参种植区土样，分离的113株菌种，其中的1株芽孢杆菌属细菌对于人参黑斑病的抑菌效果良好。强薇等[5]从人参根际土壤分离出的1株放线菌和1株木霉菌，对于人参黑斑病有明显的高拮抗活性，拮抗率分别为71.33%、71.76%。王玲[6]采用益生菌EM发酵玉米秸秆产物，施入参田，能够对人参黑斑病进行良好的防治，降低了其发病率以及病情指数。吴长宝等[7]研究发现枯草芽孢杆菌菌悬液对于人参黑斑病有较好的抑菌效果，较其发酵液效果明显，抑菌圈直径为16 mm，抑菌率为68.75%。大量文献表明，对于人参内生真菌的分离部位多为参根以及根际土壤，对于人参黑斑病侵害较为严重的叶片部位的内生真菌的分离，少有报道。因此，本试验仅仅针对人参叶片部位分离的18种内生真菌，对于人参黑斑病的拮抗作用进行筛选，以其得到较为理想的生物防治菌株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

致病菌：人参黑斑病病原真菌(AlternariapanaxWhetz)，由吉林农业大学提供。

拮抗菌株：由人参叶片提取分离得到的18种人参内生真菌。

1.2 拮抗菌株的筛选

将于-4 ℃ PDA斜面保存的人参黑斑病病原真菌活化，接种于9 cm的PDA平板，经过分离纯化，培养至菌落长满整个平板。

将从人参叶片中分离得到的内生真菌，接种于9 cm的PDA平板，不同的菌株生长速度不同，以每种菌株长满平板为标准。

试验组：采用对峙培养方法，9 cm的PDA平板，中心画十字线，选取十字线中的一条，在距离中心2 cm处各选取一点，其中一点接种上述培养方式培养的人参黑斑病病原真菌，另外一点接种人参叶片内生真菌。接种的人参黑斑病病原真菌和人参叶片内生真菌均为用7 mm打孔器打孔得到的菌饼，带菌面朝向PDA培养基接种。每种拮抗菌设置3个重复。每天观察、测量人参黑斑病病原真菌生长半径，直至对照组黑斑病病原菌长满整个平板为止，根据抑菌率计算公式，计算抑菌率。抑菌率=((对照菌丝半径-处理菌丝半径)/(对照菌丝半径-菌饼半径))×100%。

对照组：只接种人参黑斑病病原真菌，设置3个重复，每天观察、测量生长半径，绘制对照组与试验组中黑斑病病原菌的生长曲线。

每个试验组和对照组所选的黑斑病病原真菌菌饼均为同质同量，选取位置为长满平板的黑斑病病原真菌菌落的边缘。培养条件均为28 ℃，恒温培养箱倒置培养，分为初筛和复筛两部分。

数据处理：通过Excel软件对试验数据进行处理，处理方法两组间比较采用独立样本t检验法，设定P<0.05为显著性水平，P<0.01为极显著性水平。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的拮抗作用

经抑菌试验，由表1抑菌率可知，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①这5种内生真菌对黑斑病有较强的抑菌作用，其中，AXY②、AY10-1①、Ab2.2①内生真菌的抑菌率达到70%以上，AXY②的抑菌率最高，为77.5%。As②、As①为毛壳属真菌，该属真菌，目前应用于生物防治研究上较为广泛，有较高的生物防治研究价值和潜力。

表1 人参叶片内生真菌对人参黑斑病病原真菌的拮抗作用(n=3，拮抗试验第7天)

内生真菌黑斑病病原真菌半径/cm抑菌率/%Ab2.2①0.9770.9aAY10-1①0.8775.6bBY③1.2355.7cAY①2.0122.1dAXY②0.8377.5eB1.1①1.4349.3fB1.1②1.5444.1gB1.1③1.3354.0hB3.2①1.6041.3iAs①1.3056.4jAs②1.1562.4k对照组2.48

注：抑菌率中同列数据后字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 高抑菌率拮抗菌对黑斑病病原真菌生长的影响

由表1筛选出AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①，这5株拮抗效果较好的内生真菌，进一步的对峙培养表明，这5株内生真菌对黑病菌病原真菌有较好的抑制作用。其中Ab2.2①、AY10-1①、AXY②对黑斑病病原真菌的拮抗作用相当，无明显差异，AY10-1①和AXY②的病原菌生长曲线几乎重合。Ab2.2①、AY10-1①、AXY②三者的拮抗作用强于As①、As②。

2.2.1 内生真菌Ab2.2①

黑斑病菌落起初的生长呈缓慢的上升趋势，从第6天开始上升趋势增高，到第8天菌落停止生长，呈平台期。第8天时，Ab2.2①和黑斑病原菌菌落边缘开始接触，导致黑斑病病原菌停止生长，而Ab2.2①继续生长，分布在黑斑病病原菌的菌落表面上，猜想其拮抗机制，在生长初期是Ab2.2①真菌本身分泌的拮抗物质致使黑斑病的生长受到抑制，中期拮抗能力减弱，后期(生长平台期)是由于真菌本身的拮抗物质以及真菌对于病原菌的重寄生作用同时作用，产生拮抗作用。同时黑斑病病原真菌对于Ab2.2①的生长也有一定的拮抗作用，试验组的Ab2.2①的生长速度低于Ab2.2①本身生长速度，且试验组中Ab2.2①的拮抗面的菌落逐渐变薄，菌丝生长受到抑制变性。

2.2.2 内生真菌AY10-1①

试验组中黑斑病菌落生长初期在0～3 d缓慢增长，4～6 d处于平台期，在第7天以后，菌落生长速度变快，生长曲线呈上升趋势。试验组中病原菌和拮抗菌菌落在生长过程中，二者之间一直存在一定的宽度，在二者停止生长时，此宽度为0.8 cm，猜想AY10-1①其拮抗机制为真菌本身产生的活性物质，对于黑斑病的生长产生抑制作用。同时黑斑病病原真菌对于AY10-1①的生长也有较强的抑菌作用，二者属于相互竞争、相互拮抗的关系。

2.2.3 内生真菌AXY②

试验组中黑斑病菌落生长整体呈上升趋势，与AY10-1①的生长趋势相似，曲线几乎重合，拮抗作用相当，其平台期在第6～7天，起稳定抑菌作用的时间相对于AY10-1①较晚，持续时间较其短暂，且在第8天以后菌落生长呈明显的上升趋势，抑制作用减弱。但试验组中黑斑病对于AXY②的抑制作用低于对AY10-1①的作用，AXY②与黑斑病的接触面，菌丝生长的抑制不明显，菌丝未见明显的萎缩和变性。拮抗机制可能为真菌本身产生的活性物质以及与病原菌的空间竞争的共同作用。

2.2.4 内生真菌As①

生长初期，病原菌呈缓慢上升趋势，但生长速度高于Ab2.2①、AY10-1①、AXY②，略高于As②，在第5天以后，生长趋势处于平台期，病原菌停止生长，As①与黑斑病病原真菌的接触面，菌丝萎蔫，生长速度变得缓慢，且拮抗面周围的培养基颜色由暗黄色变为黄绿色，在后期覆盖黑斑病病原真菌表面生长，猜想其拮抗机制为As①与黑斑病病原真菌的空间竞争以及重寄生的共同作用。

2.2.5 内生真菌As②

黑斑病病原真菌的生长趋势与As①相同，但较As①的拮抗作用强，有明显的差异。试验组，黑斑病病原菌生长初期，菌落生长缓慢增长，在第4天以后，一直处于平台期，黑斑病病原真菌停止生长。黑斑病病原真菌对于As②的生长速度几乎无影响，As②与黑斑病病原真菌接触后依然继续生长，而后覆盖黑斑病病原真菌的表面。猜想其拮抗机制为空间竞争和重寄生的协同作用。

表2 人参黑斑病病原菌生长半径(n=3) cm

3 结论

在18株内生真菌与人参黑斑病病原真菌的拮抗试验中，共筛选出5株抑菌率在54%以上的拮抗菌株，其中AXY②、AY10-1①、Ab2.2①的抑菌率在70%以上，AXY②的抑菌率最高，为77.5%，毛壳属真菌As①、As②的抑菌率分别为56.4%、62.4%。

5种内生真菌AXY②、AY10-1①、Ab2.2①、As②、As①与人参黑斑病病原真菌的拮抗试验中，由黑斑病病原真菌的生长曲线可以看出，对照组的黑斑病病原真菌生长速度明显高于试验组的生长速度，表明这5种内生真菌对黑斑病病原真菌有着明显的拮抗作用，可用于生物防治菌株的研发。

[1] 王崇仁,吴友三,卜增山,等.人参黑斑病的研究I:损失调查、病原菌及发病规律[J].沈阳农业大学学报,1986,17(3):11-21.

[2] 李勇,赵东岳,丁万隆,等.人参内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选[J].中国中药杂志,2012,37(11):1532-1535.

[3] 贾斌,赵贞丽,沈国娟,等.人参黑斑病生防用内生拮抗菌分离鉴定及发酵浓缩液的性质[J].中国森林病虫，2014,33(3):5-10,17.

[4] 李鹏翔.中药提取物及微生物发酵提取物对人参病害抑菌效果的研究[D].长春:吉林农业大学,2012:13-15.

[5] 强薇,郭帅,张爱华,等.人参根际土壤中拮抗人参病害微生物的筛选[J].华南农业大学学报,2014,35(5):76-81.

[6] 王玲.EM菌发酵玉米秸杆条件优化及对人参黑斑病影响研究[D].长春:吉林农业大学,2012:17-18.

[7] 吴长宝,回云静,徐小明,等.枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参病原菌室内抑菌实验研究[J].人参研究,2010(4):11-13.

Screening Biocontrol Fungi against Ginseng Black Spot Pathogen//

Zhang Leiming; Xu Jiao, Liu Zhenpeng, Ren Weichao, Ma Wei

(Bei’an First People’s Hospital, Bei’an 164000, P. R. China)(Heilongjiang University of Chinese Medicine)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：89-91.

Ginseng; Endophytic fungi; Biological control; Ginseng black spot; Ginseng disease

张雷鸣，女，1988年2月生，北安市第一人民医院药局，助理药师。E-mail:229628771@qq.com。

马伟，黑龙江中医药大学药学院，教授。E-mail:88788891@qq.com。

2016年4月12日。

S476+.1

1)2013年度农业公益性行业科研专项人参产业技术研究与示范项目(201303111-04)。

责任编辑：程 红。