脱脂松仁粕中球蛋白的提取工艺及其SDS–PAGE分析

包怡红，赵楠

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脱脂松仁粕中球蛋白的提取工艺及其SDS–PAGE分析

包怡红，赵楠

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

以脱脂松仁粕为原料，采用Osborne法提取松仁粕中的球蛋白，设NaCl质量分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、料(质量，g)液(体积，mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、提取时间(30、60、90、120、150、180 min)和提取温度(40、45、50、55、60、65 ℃)4个单因素试验，再用响应面法优化松仁粕中球蛋白的提取工艺，并对其分子量进行分析。结果表明：当NaCl质量分数为2.5%，料液比为1∶15，提取时间为150 min，提取温度为56 ℃时，松仁粕中球蛋白的提取率较高，为15.32%；SDS–PAGE分析结果表明，脱脂松仁粕球蛋白的分子量为41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

脱脂松仁粕；球蛋白；提取工艺； 十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)

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红松籽(Pinus konaiensis Sieb. et Zucc)又名果松子、海松子，主要分布于东北长白山与小兴安岭一带[1]，是一种重要的药食同源的食物。早在《本草纲目》就有记载，红松籽有“味甘、小温、无毒。主治骨节风、头眩，去死肌、散水气，润肺、治燥结咳嗽，治虚秘，久服，轻身延年不老”[2–3]之功效。

目前，国内对松仁蛋白的研究主要集中在分离蛋白的提取及其生理功能的研究，如杨立宾等[4]利用超声波辅助法提取松仁蛋白并对其进行抗疲劳、免疫调节的生理功能研究；吴晓红等[5]提取松仁蛋白将其纯化并对其抗氧化性进行研究；杨丽娜[6]利用碱溶酸沉法提取松仁分离蛋白并通过动物实验验证了其降血脂的生物功效；刘轩廷等[7]对红松籽粕蛋白酶解物对小鼠NK细胞活性进行研究，而对松仁蛋白的组分蛋白研究鲜见报道。此外，由于原料产地的特殊性，国外对松仁蛋白的研究报道也较少。本研究以脱脂松仁粕为材料，采用Osborne蛋白分级法提取球蛋白，在单因素的基础上，运用响应面法优化其最佳提取工艺，并对其进行SDS–PAGE分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂松仁粕由七台河市宏泰松果有限公司提供。

试剂：氯化钠、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、甲基红、溴甲酚绿等均为分析纯；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G–250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠，由Biotopped公司提供，均为优级纯；蛋白质分子量标准由TaKaRa公司提供。

仪器与设备：分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；恒温水浴振荡器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；722型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司制造)；DYY–50型电泳仪(北京六一仪器厂)；pH计EL20(梅特勒–托利多仪器上海有限公司)。

1.2 方法

1) 脱脂松仁粕的制备。将榨取松仁油后的饼粕按1∶10的比例加入石油醚除去剩余油脂，旋转蒸发除去石油醚，烘干，即得脱脂松仁粕。

2) 蛋白质含量的测定。原料中的总蛋白含量采用凯氏定氮法测定[8]；提取液中的蛋白含量采用考马斯亮蓝法进行测定。

3) 松仁粕球蛋白的制备与测定。参照Osborne分级提取蛋白的方法，分别提取松仁粕清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。提取工艺如下：脱脂松仁粕→水溶液浸提→离心→残渣→水溶液二次浸提→离心→残渣→盐提→离心→残渣→二次盐提→离心→上清液→合并2次上清液→调至等电点→真空冷冻干燥→松仁粕球蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，再与原料中的总蛋白含量相比，得松仁粕球蛋白的提取率。

4) 松仁粕球蛋白单因素试验。以NaCl溶液为提取溶剂，按照3)工艺提取松仁粕球蛋白，设NaCl质量分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、料(g)液(mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、 1∶35)、提取时间(30、60、90、120、150、180 min)和提取温度(40、45、50、55、60、65 ℃)4个单因素试验，比较松仁粕球蛋白的提取率。

5) 响应面优化试验。根据单因素试验结果，采用响应面试验的Box–Behnken设计原理，通过Design–Expert 8.0.6软件对单因素筛选出的显著影响因素进行四因素三水平的优化试验(表1)。

表1 响应面设计的因素与水平Table 1 Experimental design of response surface methodology

6) SDS–PAGE分析。采用电泳仪进行不连续双垂直板聚丙烯酰氨凝胶电泳。参照Roshni Chatterjee等[9]方法并略有修改：将脱脂松仁粕的球蛋白提取液与样品缓冲液(10%SDS 4 mL，巯基乙醇 0.15 mL，溴酚蓝 0.02 g，甘油 2 mL，Tris–HCl(pH6.8，1.0 mol/L) 1 mL，双蒸水定容至10 mL)按体积比1∶1混合均匀，100 ℃煮沸5～10 min，4 000 r/min离心10 min，上样量为20 μL，分离胶浓度为12%，浓缩胶为5%。开始电压为80 V，进入分离胶后为120 V，电泳时间为2.5～3 h。电泳结束后固定4 h，用考马斯亮蓝R–250，50 ℃摇床染色2 h，脱色液脱色数次直至电泳条带清晰。根据标准蛋白的迁移率，计算出松仁粕球蛋白的分子量。

1.3 数据分析

数据采用Excel 2007处理；运用SPSS 21.0软件进行单因素分析处理。

2 结果与讨论

2.1 松仁粕蛋白质的含量

采用凯氏定氮法测得脱脂松仁粕中蛋白质的含量为42.37%。

2.2 松仁粕球蛋白提取单因素试验结果

当NaCl质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时，提取率分别为(1.83±0.02)%、(2.88±0.01)%、(4.85±0.02)%、(9.09±0.03)%、(8.50± 0.01)%、(8.28±0.03) %，可知，NaCl质量分数为2.0%时提取率最高。当料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35时，提取率分别为(9.63±0.10)%、(11.61±0.12)%、(11.41±0.1)%、(11.38± 0.1)%、(11.34±0.02)%、(11.26±0.014)%，可知，料液比为1∶15时提取率最高。当提取时间为30、60、90、120、150、180 min时，提取率分别为(11.71±0.11)%、(11.95±0.1)%、(12.33±0.09)%、(12.30±0.08)%、(13.15±0.06)%、(12.13±0.08)%，可知提取时间为150 min时提取率最高。当提取温度为40、45、50、55、60、65 ℃时，提取率分别为(11.52± 0.06)%、(12.85±0.09)%、(13.35±0.03)%、(14.28± 0.10)%、(13.67±0.08)%、(13.66±0.1)%，可见，提取温度为55℃时，球蛋白的提取率最高。

2.3 松仁粕球蛋白提取优化结果

2.3.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果，采用响应面对松仁粕球蛋白提取条件进行优化。利用Design–Expert 8.0.6软件对试验结果进行二次多元回归拟合，可得到球蛋白提取率(Y)和各个因子(NaCl质量分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D))之间的回归方程模型为：Y=15.18+0.11A+0.53B+0.069C+1.57D–0.77AB–0.022AC+0.31AD–0.24BC–0.025BD–0.098CD–2.25A2–1.36B2–1.22C2–2.62D2，回归模型P＜0.000 1，表明此模型极显著；失拟项P＞0.056 7，说明没有失拟项产生；相关系数R2=0.937 7，说明该模型与试验值之间有较好的拟合度。在各个因素中，按影响大小依次为提取温度、料液比、NaCl质量分数、提取时间。由回归模型可知，NaCl质量分数与料液比的交互作用对松仁粕球蛋白提取率线性效应显著(P＜0.05)。根据上述方程绘制响应面(图1)，得出最佳提取工艺为NaCl质量分数2.38%，料液比1∶14.88，提取时间150.26 min，提取温度56.12 ℃，提取率可达15.18%。

图1 NaCl质量分数和料液比交互作用下松仁粕球蛋白的提取率Fig.1 Globulin yield from defatted pine nut under different mass fraction of NaCl and liquid-solid ratio

2.3.2 验证试验结果

通过响应面得到的最佳提取工艺，考虑实际操作方便，将提取条件修正为NaCl质量分数为2.5%，料液比为1∶15，提取时间150 min，提取温度56 ℃。在此条件下，松仁粕球蛋白的提取率为15.32%，与模型预测值之间的误差为0.92%，说明该响应面得出的模型是可靠的。

2.4 SDS–PAGE试验结果

球蛋白的SDS–PAGE分析结果如图2。从图2可以看出，松仁粕球蛋白的亚基分布范围集中在44 300～ 14 300，主要条带分别为41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

图2 松仁粕球蛋白的SDS–PAGE结果Fig.2 Results of SDS–PAGE from pine nut globulin

3 结论与讨论

松仁粕中球蛋白的提取涉及的各个因素均会对其提取率造成一定的影响。本试验结果表明，松仁粕球蛋白的提取率随提取剂NaCl质量分数的升高而增加，但当NaCl质量分数升高至2.0%以上时，提取率不再增加，这与程皓[10]提取脱脂米糠中球蛋白的研究结果趋势相一致。这主要是由于蛋白质具有盐溶性质，低浓度的盐溶液会增加蛋白质表面的电荷数量，提高蛋白质在溶液中的溶解性，因此，低浓度的盐溶液能够促进蛋白质的溶出，但当盐溶液的浓度继续升高时，蛋白质的表面电荷被大量中和，从而降低了球蛋白的溶解度。球蛋白的提取率随着料液比的增加而增加，当料液比为1∶15时，球蛋白的提取率最高，之后呈下降趋势。可能是由于料液比值变小，松仁粕球蛋白与脱脂松仁粕之间的吸附力大于其与提取剂之间的相互作用，使松仁粕种球蛋白的溶出减少，这与王艳玲等[11]提取脱脂米糠中球蛋白的研究结果一致。随着温度的升高，溶液中分子的扩散运动加剧，从而促进蛋白质的溶出，当温度为55 ℃时，球蛋白的提取率趋于平稳，温度过高会使蛋白质部分性质发生改变，导致蛋白的提取率无明显变化。

对球蛋白分子量的测定采用的是十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)[12–14]，由于不同分子量的物质通过胶孔的速度不同，进而可将球蛋白中存在的不同分子量的蛋白亚基分离开来。本试验结果表明，松仁粕中球蛋白的亚基分布范围集中在44 300～14 300，而王晓飞等[15]提取长白山核桃球蛋白的分子量范围为14 300～59 000，孙琳琳[16]提取的长白山核桃楸的球蛋白的分子量为18 500～ 22 000、30 000～33 500和49 000～56 000的条带，松仁粕球蛋白的分子量比长白山核桃球蛋分子量小。

综上所述，松仁粕中球蛋白提取最佳工艺：NaCl质量分数2.5%，料液比1∶15，提取时间150 min，提取温度56 ℃，在此条件下球蛋白的提取率为15.32%。松仁粕中球蛋白的SDS–PAGE分析结果表明，松仁粕球蛋白的分子量为41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

Optimization of extraction globulin from defatted pine nut meal and analysis of SDS–PAGE

Bao Yihong, Zhao Nan
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China)

Defatted pine nut meal was used as material, four single factors of NaCl extraction solvent (0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% and 3.0%), ratio of material to solvent (1∶10, 1∶15, 1∶20, 1∶25, 1∶30, and 1∶35), extraction time(30, 60, 90, 120, 150, and 180 min) and extraction temperature (40, 45, 50, 55, 60, and 65 ℃) were designed to extract globulin by the method of Osborne and to improve extraction process by response surface method and to analyze relative molecular mass of globulin by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). The result showed that the optimum extraction conditions were 2.5% of NaCl, extraction at 56 ℃ for 150 min with ratio of material to solvent 1∶15, the extraction ratio of globulin was up to 15.32%, and the relative molecular mass of the proteins were 41 320, 27 520, 21 690, 16 310, 15 180.

defatted pine nut; globulin; extraction process; sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE)

TS201.2

A

1007-1032(2016)06-0654-04

2016–03–23

2016–10–15

中央高校科研业务费专项(2572014EA02)；哈尔滨市科技创新人才项目(2015RAXXJ010)

包怡红(1970—)，女，黑龙江哈尔滨人，博士，教授，主要从事食品生物技术与功能食品研究，baoyihong@163.com