湖南地方柚资源及其近缘种多样性的SRAP分子评价

李先信，杨迎花，邹学校，邓子牛

(1.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院 a.园艺研究所；b.蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；3.株洲市农业局，湖南 株洲412007；4.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128)

湖南地方柚资源及其近缘种多样性的SRAP分子评价

李先信1,2a，杨迎花3，邹学校2b，邓子牛4*

(1.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院 a.园艺研究所；b.蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；3.株洲市农业局，湖南 株洲412007；4.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128)

以湖南本地柚类资源为试材，应用SRAP标记对41份柚类资源及5份近缘种的遗传多样性进行分析与鉴定。结果表明：平均每个引物组合可扩增出16.6条谱带，17对SRAP引物共扩增出283条谱带，其中多态性谱带235条，多态率为83.0%，基因多样度变幅为0.431 7～0.770 0，平均基因多样度为0.544 3；获得了21个基因型的37个SRAP特异性标记，不同引物组合可将42个基因型完全分开；柚类及近缘种等位基因平均数、平均杂合位点占比、SRAP表型杂合度(H0)分别为9.02、67.77%和0.343。聚类分析结果显示，41份柚种质及5份近缘种材料在遗传相似系数0.792处可分为6个组群：第1、2组群分别由24个和11个柚的地方品种构成；第3组群为柚的种间杂种类型，包括菠萝香柚、慈利金香柚、慈利甜柚2号和慈利水柚子；第4组群由慈利柚09–1、金瓜两杂种柚和酸橙、臭皮柑两近缘种组成；第5组群包括无核大红甜橙和温州蜜柑；第6组群为柠檬。综合SRAP标记结果与形态特征分析，认为慈利金香柚可能源于以柚类为母本、以橙类(或宽皮橘类)为父本的自然种间杂交后代。

柚；遗传多样性；种质鉴定；湖南

投稿网址：http：//xb.ijournal.cn

Keywords： pummelo (Citrus grandis Osbeck); genetic diversity; germplasm identification; Hunan

柚(Citrus grandis Osbeck)是柑橘属的3个基本种之一，是一类重要的种质资源[1]，也是中国柑橘类中三大栽培种之一。中国作为世界柚类的原产地和遗传变异中心，不仅有丰富的种质资源，而且有长达3 000多年的栽培历史[2]，柚类栽培遍及中国南部10多个省市自治区，已形成东南沿海地区、华南地区和西南地区3大柚产区[3]。目前中国选育和栽培的柚类品种、品系、类型和株系达200个以上[4]。湖南是中国内陆性系统柚种质的多样化分布中心之一[2]，蕴藏的柚类种质资源极其丰富，经过长期的自然演化与人类有目的的选择与栽培后，柚类资源发生了广泛的变异，形成了众多的种群类型[5–6]，但对其进行的系统研究尚少。因为对柚类资源的丰富度与特色缺乏了解，所以地方柚资源的开发利用一直受到限制。深入、系统地研究地方柚类资源的遗传变异与种群构成，分析其遗传多样性，对于有效保护与合理利用柚资源十分必要。

SRAP具有多态性丰富和操作快捷、简便及不需要预知物种的序列信息等特点，已被广泛应用在果树的遗传多样性检测[7–8]、种质鉴定[9–10]、遗传图谱构建[11]等领域。本研究中采用SRAP技术对湖南省41个地方柚资源及其5个近缘种进行遗传多样性分析与评价，以期更好地为保护与开发利用柚资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

所用41个柚资源及其5个近缘种材料均采自湖南省境内(表1)。为更好地确定柚类种质间的遗传关系，选取酸橙、大红甜橙、柠檬、臭皮柑和温州蜜柑等柚的近缘种作为参照。

表1 41个柚种质及其5个近缘种材料Table 1 41 pummelo germplasms and 5 relative species

1.2 DNA的提取与检测

参照程运江等[12]的方法提取幼叶基因组DNA。DNA经纯化后用1.0% 的琼脂糖电泳检测，并用核酸蛋白质仪检测其浓度与质量，然后稀释DNA浓度至50 ng/μL，–20 ℃保存，备用。

1.3 SRAP–PCR反应体系和扩增

PCR扩增反应在Biometra Tgradient上进行。25 µL 的反应体系包括：3 µL 10×Tris–HCl，1.6 mmol/L MgCl2，0.12 mmol/L dNTP，0.4 U Taq DNA聚合酶，各0.1 μmol/L的上、下游引物，50 ng模板DNA。PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min后进行5个循环 (94 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min)， 然后再进行35个循环 (94℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min)，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。在2%的琼脂糖凝胶电泳上分离扩增产物，并在凝胶成像系统下观测、照相，检测PCR效果。

1.4 SRAP引物的合成与筛选

按照文献[6]的原则设计引物。共设计合成10个正向引物和11个反向引物,组成110对SRAP引物组合进行筛选(引物由上海生物工程技术有限公司合成)，选取扩增谱带清晰、多态性稳定的引物组合进行后续分析，10个正向引物为Me1，Me2，Me3，…，Me10；11个下游引物为Em1，Em2，Em3，…，Em11。

1.5 数据分析

用筛选出的SRAP引物组合分析、鉴定柚类的种质及其近缘种的遗传多样性。根据扩增谱带的“有”与“无”来统计扩增结果，将迁移位置相同的谱带记为一个位点，同一位点上有谱带记为“1”，无谱带记为“0”，依此对所有扩增谱带的原始数据进行统计，构建(0, 1)矩阵，并输入计算机计算各位点在总样本中的基因多样度。参照Zhen等[13]的方法计算各品种的等位基因平均数、杂合位点占比，按Nei等[14]的方法计算各品种的平均SRAP表型杂合度。采用NTSYS–PC2.10e分析软件计算各基因型间的遗传相似系数。采用UPGMA方法进行聚类分析，获得聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 SRAP引物的PCR扩增效率与多态性

用安江沙田柚、中秋蜜柚、慈利金香柚、胡柚、大红甜橙和酸橙共6个差异较大的材料进行引物筛选，从110对引物中筛选出17对能产生清晰多态性谱带的引物。这些引物能检测出至少9个、最多29个的基因位点。利用筛选出的引物组合对41个柚及其5个近缘种材料进行PCR扩增，共检测到283个基因位点，平均每对引物检测到16.6个位点，其中多态性位点235个，多态性位点占检测到的总位点的比例达83.0%(各引物组合的多态性位点占比为57.9%～95.2%)。在283个位点上共扩增出7 051条谱带，其中多态性谱带5 853条，平均每对引物在各基因型中检测到的多态性谱带为7.5条；平均每个位点检测到9.02个等位基因，在检测的所有位点上，等位基因数最多的引物组合是Me1/ Em2，最少的是Me7/Em11和Me8/Em2；基因多样度变幅为0.431 7(Me8/Em1)～0.770 0 (Me5/Em9)，平均基因多样度为0.544 3(表2)。统计结果表明，46份基因型中有21份产生了37个特异性遗传标记(图1圆圈所示)， 用17对SRAP引物可将46份资源中的42份资源区别开来。

图1 SRAP引物Me8/Em7对41份柚资源及5个近缘种的扩增图谱Fig.1 Electrophorogram of 46 pummelo germplasms and their relatives amplified by SRAP primer Me8/Em7

表2 SRAP检测的位点数、多态性位点占比与基因多样度Table 2 No. of loci, percentage of polymorphic loci and value of gene diversity detected by SRAP

表2(续)

2.2 柚类资源及其近缘种的遗传变异

在41份柚类种质及其5份近缘种中，等位基因平均数最大的品种为江永酸柚(10.53)，最小的为慈利金香柚(7.29)，平均值为9.02；杂合位点占比最大的品种为江永酸柚 (72.63%)，最小的品种为慈利金香柚(60.48%)，其平均值为67.77%；SRAP 表型杂合度平均值为0.343。由聚类分析结果可知，各种群之间，杂合位点占比和平均SRAP表型杂合度均以柚类近缘种的最高，分别为69.69%、0.410，以杂种柚品种群的最低，分别为64.10%和0.312，以沙田柚为主的品种群和以文旦柚为主的品种群介于近缘种与杂种柚品种群之间，其中文旦柚品种群的杂合位点占比(68.27%)略高于沙田柚品种群的(68.16%)，而平均SRAP表型杂合度以沙田柚品种群的略高于文旦柚品种群的。在种群内，杂合度以沙田柚品种群的辰州香柚和文旦柚品种群的江永酸柚的最高，分别为0.381和 0.398，而以白玉霜柚和安江香柚的最低，分别为0.302和0.287；种间杂种中以大庸金瓜的杂合度 (0.368) 最高，以慈利香柚的杂合度 (0.269) 最低；近缘种中以臭皮柑的杂合度 (0.385) 最低，以柠檬的杂合度 (0.439) 最高(表3)。

表3 柚类种质及其近缘种的遗传变异分析结果Table 3 Genetic variability of pummelo germplasm and their relatives

表3(续)

2.3 柚类资源及其近缘种的UPGMA聚类分析结果

由SRAP数据统计结果计算出的41份柚资源及其5份近缘种两两种质间的遗传相似系数可知，不同基因型间最大的遗传相似系数为0.950 5(江永香柚与江永酸柚的)，最小的为0.554 8(安江红心柚与柠檬的)，平均相似系数为0.736 9。在柚种群内以江永香柚与江永酸柚的遗传相似系数最大，为0.950 5，其次是吉首红心柚与江永蜜柚的，为0.936 3。近缘种与柚类群之间以杂种柚‘慈利柚09–1’与臭皮柑的遗传相似系数最大，为0.816 3，以安江红心柚与柠檬之间的最小，为0.554 8。外类群之间以臭皮柑与酸橙的遗传相似系数最大，为0.929 3，而以柠檬与温州蜜柑的最小，为0.724 4。

由41个柚类及其5个近缘种基因型283个位点的SRAP标记聚类分析结果(图2)可知，以遗传相似系数0.792为临界点，41份柚类资源与5份近缘种聚类成6个组群。第I组群由1～24号共24个地方柚类品种组成；第Ⅱ组群由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37号共11个柚类品种组成；第Ⅲ组群由35、36、38、40号共4个杂种柚类型组成；第IV组包括39、43号2个杂种柚和41、44号2个近缘种；第V组群为42、46号近缘种；第VI组为45号近缘种。

图2 41份柚资源及其5份近缘种的SRAP聚类分析图Fig.2 Dendrogram of 41 pummelo germplasms and their 5 relatives based on SRAP markers

第I 柚组群在遗传相似系数0.819时可以分为5个亚组，第1亚组有1、2、3、4、5、6、7、18、19号共9个品种，由沙田柚类群品种和文旦柚类群品种交互聚类而成，其中江永香柚与江永酸柚紧密地聚在一起，两者的相似系数高达0.950 5；第2亚组由23、24号共2个品种组成，为文旦柚品种群；第3亚组包括8、10、11、12、13、14、15、17、20共9个品种，为文旦柚品种群；第4亚组为16、21、22号共3个品种，主要为文旦柚品种群；第5亚组为9号品种。

在相似系数0.849处第Ⅱ柚组群亦可分为3个亚组。第1亚组包括33、34号2个品种，为沙田柚品种群；第2亚组包括25、26、27、28、29、30、31、32号共8个品种，除30号外，主要为文旦柚品种群；37号慈利香柚单独构成第3亚组。

3 结论与讨论

关于利用SRAP标记鉴定柚类遗传多样性的可行性问题。SRAP标记主要以开放读码框(ORFs)中的外显子为主要目标对外显子区域进行特异扩增，因不同个体的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。SRAP标记以其丰富的多态性被广泛地应用于柑橘等果树品种的遗传多样性分析[7–10]。笔者对湖南地方柚类资源及其近缘种进行研究，用17对SRAP引物共检测到283个基因位点，其中多态性位点235个，平均每对引物检测到16.6个基因位点，平均每个位点的等位基因数9.02个，多态性位点占比为83.0%，高于利用RAPD[15]对79份柚种质及近缘种的多态性(81.71%)，也高于利用AFLP[16]对122份柚资源及近缘种的多态性(72%)，且每对SRAP引物检测到的多态性带数(13.8条)亦明显高于ISSR[17](6.5条)和SSR[16](10.7条)每对引物检测的多态性带数。在46份基因型中有21份产生了37个特异性遗传标记，利用筛选的SRAP引物组合可以将42份基因型区别开来，因此，利用SRAP标记来分析评价柚类资源的遗传多样性、鉴定品种是非常有效的。

关于湖南地方柚类资源各类群与其近缘种间的遗传差异问题。杂合度是度量物种群体遗传变异的重要参数，能反映出各群体在多个位点上的遗传变异。本研究分析结果表明，湖南地方柚类资源及近缘种的平均杂合位点占比、SRAP表型杂合度平均值分别为67.77%和0.343，与刘勇[18]等用SSR标记分析的结果类似，但在本研究中杂合位点占比、平均SRAP表型杂合度最高的为近缘种(分别为69.69%、0.410)，最低的是杂种柚品种群(分别为64.10%和0.312)，而以沙田柚为主的品种群和以文旦柚为主的品种群介于近缘种与杂种柚品种群之间，其中文旦柚品种群的杂合位点占比(68.27%)略高于沙田柚品种群的(68.16%)，而平均SRAP表型杂合度以沙田柚品种群的(0.345)略高于文旦柚品种群的(0.338)。试验结果反映出柚类资源不同类群之间以及柚类资源与其近缘种间显著的遗传差异，同时也反映出湖南地方柚类资源及其近缘种间丰富的遗传多样性。

关于慈利金香柚的亲本起源问题。慈利金香柚是湖南省的特色柚类良种，主要分布于慈利、常德、石门、桑植、张家界、吉首等县(市)。该品种母株原为回蔸树，通常被认为是柚的芽变良种，但从其形态学性状看，其树形、树姿、树冠大小介于柚和橙之间，叶片大小及形状与橙类相似，花瓣大多数为5瓣，与橙类和橘类相似，花的大小也介于柚类与橙类或柚类与橘类之间，果实的形状、大小、果皮厚度等形态性状与柚类相似，而果皮色泽橙红色与橙类相似，表明慈利金香柚具有橙与柚的部分特征。SRAP聚类分析结果表明，慈利金香柚与菠萝香柚、慈利甜柚2号、慈利水柚子等种间杂种柚紧密聚在一起，构成第IV类群，其遗传相似系数分别为0.858 7、0.826 9和0.826 9，说明其亲缘关系较近，彼此间应有相似或共同的亲本来源。该结果与笔者基于形态性状的聚类分析结果[19]完全吻合。综合形态与SRAP标记结果分析，认为慈利金香柚起源于杂种后代，属于柚类与橙类或柚类与宽皮橘类的自然种间杂种，但其确切的亲本来源尚需进一步研究确定。该猜想印证了钟广炎等[20]应用同工酶分析的研究结果。从形态性状和遗传相似系数判断，慈利金香柚和慈利水柚子可能是以柚类为母本、以橙类(或宽皮橘类)为父本进行自然杂交所得，而菠萝香柚和慈利甜柚2号可能是以橙类(或宽皮橘类)为母本、以柚类为父本自然杂交而来。杂种柚品种慈利柚09–1和大庸金瓜与近缘种臭皮柑和酸橙聚类为第V类群，说明他们的起源与近缘种臭皮柑和酸橙有关。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Molecular level’s evaluation on the genetic diversity of pummelo germplasm and their relative species in hunan province based on srap markers

Li Xianxin1,2a, Yang Yinghua3, Zhou Xuexiao2b, Den Ziniu4*
(1.Longping Branch of Central South University, Changsha 410125, China; 2.a.Horticultural Research Institute; b.Vegetable Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 3.Zhuzhou Agriculture Bureau, Zhuzhou, Hunan 412007, China; 4.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Genetic diversity of 41 pummelo (Citrus grandis Osbeck) germplasms and 5 relative species collected from Hunan province were identified and evaluated using the markers from sequence related amplified polymorphism (SRAP). The results showed that the average number of 16.6 alleles could be amplified out from every primer combination, and total of 283 alleles were detected from 17 SRAP markers, 235 out of which presented polymorphic, accounted for 83.0%. Gene diversity value changed from 0.431 7 to 0.770 0 with an average of 0.544 3 for each primer, which showed a high level of genetic diversity among the analyzed germplasms. 37 specific SRAP polymorphic bands were scored, and 42 genotypes from the 46 germplasms were completely identified by SRAP markers. The mean number of alleles per locus (A), percentage of polymorphic loci (P) and direct count heterozygosity (H0) of the genotypes from the pummelo germplasms and their relative species were 9.02, 67.77% and 0.343, respectively. 41 pummelo germplasms and 5 relatives could be clustered into 6 groups with the similarity coefficient of 0.792 by the method of UPGMA. Group 1 and group 2 were respectively composed of 24 and 11 pummelo varieties, group 3 was hybrid pummelos, group 4 was two of hybrid pummelos and two relatives, group 5 included two relatives of seedless red peel orange and Satsuma mandarin, and group 6 was only limon (Citrus limon (L.) Burm f.). Parental origin of the hybrid pummelos were discussed in the paper as well.

S666.3

A

1007-1032(2016)06-608-07

2016–09–15

2016–09–20

湖南省农业科学院科技创新团队项目(2014td04)；中南大学博士创新基金项目(2340–77226)

李先信(1962—)，男，湖南浏阳人，博士研究生，研究员，主要从事柑橘资源与育种研究，nkylxx118@163.com；*通信作者，邓子牛，教授，博士，主要从事柑橘遗传育种研究，deng7009@163.com