纤维素分解菌的分离选育

闫荣荣

(太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008)



纤维素分解菌的分离选育

闫荣荣

(太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008)

以含腐草的土壤为样品，通过土样稀释，选择培养基培养初筛，将初筛选择出的菌株在CMC-Na培养基上进行多次复筛，通过刚果红染色观察透明圈，CMC糖化力法测纤维素酶活力进一步筛选，选择出1菌株与15菌株为该次实验的优良菌株。

纤维素；分解菌；分离；选育

纤维素是地球上最丰富的生物多聚物，是一种巨大的可利用再生资源。但由于纤维素特殊的结构特点，对于其利用仍然十分有限。其中，尤以农作物秸秆为甚，我国年产秸秆约6亿t，目前仅有20%的纤维素被开发利用，主要用作燃料、堆肥与牲畜饲料等，甚至因无法利用而被废弃，这样，不仅浪费资源，而且会对环境产生不利影响。纤维素的高效资源利用得力于纤维素的分解，但由于生产纤维素酶的成本很高，从而阻碍了纤维素酶水解的实际应用[1]。因此，筛选出具有高活性纤维素酶的纤维素分解菌对纤维素的利用具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品为某学院富含纤维素分解菌的草坪土壤。

1.2 培养基

1) 刚果红-纤维素培养基：刚果红0.2 g，磷酸氢钾0.5 g，微晶纤维素2.0 g，硫酸镁0.25 g，硫酸铵2.0 g，琼脂14.0 g，去离子水1 000 mL。观察纤维素分解菌透明水解圈大小。

2) CMC培养基：羧甲基纤维素钠10 g，磷酸氢钾0.5 g，酵母膏1.0 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂3.0 g，硝酸铵1.0 g，1 000 mL的无菌水并于121 ℃灭菌20 min。

3) 产酶培养基：磷酸二氢钠3.0 g，硫酸铵2.0 g，尿素0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钙0.5 g，七水硫酸亚铁7.5 mg，一水硫酸锰2.5 mg，硫酸锌2.0 mg，羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨1 g，酵母膏10 g，琼脂3.0 g，1 000 mL的无菌水并于121 ℃灭菌20 min。

4) 肉汤培养基：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏5 g，1 000 mL的无菌水并于121 ℃灭菌20 min。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的采集与稀释

1) 在校园绿化区内挖取含腐草根与腐质叶的土壤作为样品。

2) 腐质土壤样品稀释溶液的制备：称取10 g草地中含腐草根的土壤放入带玻璃珠的90 mL瓶装无菌水中，机械振荡20 min，使土样分散。

3) 用梯度稀释法对土样悬液进行系列稀释。

1.3.2 纤维素分解菌的筛选分离

1) 初筛：将稀释的土样悬液利用无菌接种枪吸取0.2 mL样品稀释液于灭过菌的初筛分离平板上，涂布，28 ℃～29 ℃培养7 d。

2) 复筛：再将初筛出的菌株通过划线接种于CMC-Na平板上，28 ℃～29 ℃培养3 d，进行增殖。

3) 刚果红染色：将增殖后的菌株用划线法接种于CMC-Na平板上，28 ℃～29 ℃培养3 d后，用刚果红进行染色5 min，染色完成后倾去染液测溶解圈直径。

4) 富集：以复筛出的生长快、红色浓郁、透明溶解圈较大的混菌株为对象，将其划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，28 ℃～29 ℃培养2 d，如此反复多次，进行分离，保存。

5) 提取粗酶液：将分离得到的菌株分别接种到装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，28 ℃～29 ℃振荡培养5 d。然后，在4 000 r/min离心速度下，离心5 min，取上清液作为粗酶液。

1.4 纤维素酶活的测定

取20 mL刻度试管，加入酶液0.5 mL和醋酸缓冲溶液(0.1 mol/L、pH=4.6)，摇匀。加入CMC-Na溶液1.5 mL，40 ℃水浴保温30 min后，马上加入1.5 mL DNS显色剂，沸水水浴5 min，取出冷却后，定容至20 mL，在波长540 nm处测得吸光度As。设置空白对照组。酶活力的计算公式如式(1)。

酶活力(u/g)=P×K×1 000/0.5×30

(1)

式中：P为葡萄糖体积分数，%；K为稀释倍数，倍。

2 结果与讨论

2.1 纤维素分解菌的筛选结果

从含腐草根与腐质叶的土壤经过数次初筛培养基与复筛培养基的培养筛选，挑选出16株菌种并测定其生长速率，结果见表1。

表1 刚果红染色后菌种在平板上的生长情况

平均生长率数值较大，则溶解圈出现时间相对较早，其直径也相对较大[2-4]。因此，本实验选取平均生长率为0.20以上的菌株，编号为1、6、10、13、14和15的菌株。

2.2 CMC酶活力筛选

将复筛出的1、6、10、13、14和15菌株接种于液体发酵培养基，制成菌悬液并测定其吸光度，在葡萄糖标准曲线上算出对应还原糖的量，计算其纤维素酶活力。结果见表2。

表2 筛选菌株CMC酶活力表

由表2可知，纤维素产酶曲线的高峰期一般出现在培养的第3 d与第4 d。菌株1和菌株15拥有最高纤维素酶活力，分别达到4.85U和4.69U，峰值都出现于培养的第3 d。菌株10与菌株14相对而言较为特别，该2株菌株峰值出现在第4 d，说明其产酶较于其他菌株较晚。菌株6纤维素酶活力最弱。所以选择菌株1和菌株15为最终优良菌株。

2.3 菌株形态观察

在双目显微镜下观察筛选出的菌株为球菌，通过革兰氏染色显示为紫色，所以该菌株为革兰氏阳性菌。

3 结论

1) 从纤维素分解菌含量较多的含腐草土壤中采样，利用选择培养基进行初筛、复筛和刚果红染色，选出透明圈较大的菌株菌1、6、10、13、14、15，通过CMC酶活力测定选出1菌株和15菌株为产酶优良菌株。

2) 经双目显微镜观察该菌株为球菌，革兰氏染色为阳性。

[1] 李日强，王爱英，孔令冬，等.一株纤维素分解菌的分离选育[J].山西大学学报(自然科学版)，2006,29(3):317-320.

[2] 冯健玲，姚晓华，韦秉兴，等.一株纤维素分解菌的初步鉴定及酶活检测[J].江苏农业科学,2010(1):329-330.

[3] 石伟.高产纤维素霉菌的筛选及其在青贮饲料中的应用研究[D].西安：西北大学,2008.

[4] 聂麦茜，刘加昌，朱玉玺，等.纤维素降解菌筛选分离与CMC酶提取及其活性研究[J].安徽农业科学,2008,36(9):7956-7958.

Isolation and screening of cellulose decomposing bacteria

YAN Rongrong

(Department of Environmental and Safety Engineering, Taiyuan Institute of Technology, Taiyuan Shanxi 030008, China)

Taking soil containing rotten grass as samples, through the soil sample dilution,the selected strains in CMC Na by culturing on a preliminary screening medium are screened for many times.The strains coded as 1 and 15 are finally identified as the effective strains of the experiments by congo red staining observation of transparent circle and CMC saccharifying power measuring cellulose enzyme vigor.

cellulose; decomposing bacteria; isolation; screening

2016-07-11

闫荣荣，女，1981年出生，2006年毕业于太原理工大学，硕士学位，助教，主要从事水体污染处理研究工作。

科研与开发

10.16525/j.cnki.cn14-1109/tq.2016.05.11

X172

A

1004-7050(2016)05-0038-02