蓝莓组织培养污染细菌的分离与鉴定

靳 松，尹利方，夏体渊*，李 冰，徐胜光，任 禛，张永福，牛燕芬，刘一鸣

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214；3.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223)



蓝莓组织培养污染细菌的分离与鉴定

靳 松1,2，尹利方1*，夏体渊1**，李 冰3，徐胜光1，任 禛1，张永福1，牛燕芬1，刘一鸣1

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214；3.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223)

对污染蓝莓组培苗的细菌进行分离和鉴定，为防治蓝莓组织培养过程中细菌污染提供科学依据。采用NA培养基分离纯化细菌，通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对引起蓝莓组培苗污染的细菌进行鉴定。引起蓝莓组培苗污染的细菌为菌株LM53和LM85，16S rDNA序列分析结果表明，LM53和B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)聚在同一系统发育分支，同源性为99.9 %～100 %；LM85与苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis(ACNF01000156)聚在同一系统发育分支，同源性为99.7 %。生理生化指标分析表明，LM53与地衣芽孢杆菌相符；LM85与苏云金芽孢杆菌相符，因此确定引起蓝莓组培苗污染的细菌LM85为苏云金芽孢杆菌，LM53为地衣芽孢杆菌。

蓝莓；组织培养；污染；细菌；分离；鉴定

蓝莓，又称越桔或蓝浆果，属于杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，多年生落叶或常绿灌木，原产于北美。全世界约400个种，中国约91个种28个变种，分为兔眼蓝莓、高丛蓝莓、矮丛蓝莓3个类别，主要分布于东北和西南地区[1]。蓝莓果中含有花色素苷、黄酮等多种多酚类生理活性物成分，联合国粮农组织将蓝莓列为人类五大健康食品之一[2-4]。蓝莓的常规繁殖方法较多，有种子育苗、绿枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等[5]，但繁殖系数低，生长速度慢，品种易退化。利用组织培养的方法可以在短期内大大提高繁殖系数，缩短繁殖时间，并且可以保持品种的优良特性，现己成为近年来众多学者研究的热点之一[6-8]。

在蓝莓组培快繁过程中，虽然在初代培养过程中没有出现污染，但是在继代培养1～2代后，接种2～3 d后出现细菌污染，污染率高达10 %以上，一旦被污染，白色菌苔很快布满培养基表层及外植体的基部，大量消耗营养；外植体停止生长，逐渐枯萎死亡，严重影响组培苗的正常生长和继代。本研究通过NA培养基分离纯化细菌，再通过形态特征、生理生化指标结合16S rDNA序列同源性分析，对2株引起蓝莓组织培养污染的细菌进行了鉴定，为后期蓝莓组织培养污染的预防、无性繁殖技术体系的顺利建立提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

污染的蓝莓“康维尔(Coville)”组培苗由昆明学院农学院植物组织培养实验中心提供。

1.2 培养基

细菌分离和培养用NA培养基，液体培养用LB培养基，细菌DNA提取，16S rDNA片段扩增所用的各种酶、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程(大连)产品，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌的分离纯化及保藏

挑取污染菌苔接种于NA培养基上进行划线纯化，挑取单菌落于试管斜面中4 ℃保存。

1.4 形态特征观察及生理生化指标的测定

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取细菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。PCR反应体系(50 μl)组成：10×PCR缓冲液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[11](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (约50g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，双蒸水35.5 μl。PCR扩增按Sambrook方法进行[12]。扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。将测得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)进行同源性搜索[13]，通过MEGA4.0进行比对，随后选用Maximum Composite Likelihood距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法(1000次重复)检验。用Megalign软件，将这些序列用Clustal W法进行多序列比对，建立系统发育进化距离图。

2 结果与分析

2.1 形态特征观察及生理生化指标的测定

将污染菌苔(图1a)用平板划线法进行分离和纯化，得到纯化菌株2株，即LM85(图1b)和LM53(图1c)。菌株LM85(图1b)在NA培养基上呈乳白色不透明菌落，菌落多为圆形，表面湿润无光泽，边缘不整齐，芽孢直杆状(图2)，约2 μm。菌株LM53(图1c)在NA培养基上呈乳白色不透明菌落，菌落圆形，表面湿润无光泽，边缘整齐，芽孢直杆状(图3)，约2 μm。依据常见细菌鉴定手册，LM85生理生化指标均与苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis特征相同；LM53生理生化指标均与地衣芽孢杆菌B.licheniformis特征相同(表1)。

a:被污染的蓝莓组培苗；b:LM85在NA培养基上的菌落形态；c:LM53在NA培养基上的菌落形态a:Blueberry’s cultivation seedling polluted by the strain LM53 and LM85; b:Colony morphologies of LM85 on NA culture medium; c:Colony morphologies of LM53 on NA culture medium图1 细菌的形态特征Fig.1 The morphology of strain LM85 and LM53

图2 LM85的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain LM85 under light microscopy (magnification, 1000×)

图3 LM53的芽孢染色(放大1000×)Fig.3 Spore morphologies of strain LM53 under light microscopy (magnification, 1000×)

生理生化指标IndexesofphysiologyandbiochemistryLM85LM53细胞直径>1μm+-芽孢圆形--孢囊膨大--伴孢晶体d-厌氧生长++V-P测定++接触酶反应++葡萄糖产气--水解淀粉++耐1%～7%氯化钠++D-葡萄糖++L-阿拉伯糖-+D-木糖-+D-甘露醇-+形成吲哚--丙酸盐利用ND+水解酪朊++酪氨酸水解d-硝酸盐还原++5℃--10d-30++

续表1 Continued table 1

生理生化指标IndexesofphysiologyandbiochemistryLM85LM5340++50-+55-+65--有溶菌酶时生长+dH+2CO2或CO自养生长--

表2 用于构建系统发育树的菌株相关信息

2.2 16S rDNA序列分析

通过BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)将本研究所得序列LM85和LM53提交到Genbank数据库中，登录号分别为KP900946和KP900947。将菌株LM85和LM53的16S rDNA与从GenBank中获取与该菌株序列同源性较高的部分菌株16S rDNA序列构建系统发育树(表2)，LM85与苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis(ACNF01000156)在同一系统发育分支(图4)，同源性为99.7 %(图5)。LM53菌株与B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)在同一系统发育分支(图4)，同源性为99.9 %～100 %(图5)。LM85的分子鉴定结果与生理生化鉴定结果一致，结合LM53的生理生化鉴定结果(表1)，将LM53鉴定为地衣芽孢杆菌B.licheniformis。

括号中的序号为Genbank登录号；分支上的数字为自展值百分比；线段0.005为核酸替换率Genbank accession numbers were shown in the parentheses; The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap; Bar:0.0005 subsitutions per nucleotide position图4 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

图5 系统发育进化距离Fig.5 Sequence distance of LM85 and LM53 based on 16S rDNA full-length sequence

3 讨 论

Leifert14]等研究表明，在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植体周围的培养基表面形成明显的水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落；而在外植体培养后3～5 d后才出现的细菌菌落，则可能是由细菌引起的污染。本研究中，蓝莓外植体在接种2～3 d后出现细菌污染，推测是由于接种操作过程中，无菌操作不严，外植体表面细菌引起的污染。

通过形态特征、芽孢染色和16S rDNA序列同源性分析，表明引起蓝莓组培苗污染的细菌是苏云金芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，属于革兰氏阳性菌，由于革兰氏阳性菌细胞壁的特殊成分，使大多数革兰氏阳性菌对青霉素敏感，因此，可以筛选出一部分既能抑制细菌生长但对植物的生长不产生影响的抗生素应用于蓝莓的组织培养。在组织培养污染防治的研究中，在培养基中加入抗生素或防腐剂的方法已有报道。Reed[15]等在天竺葵(Pelargoniumhortorum)组培中发现头孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且对芽的增殖有促进作用。韩美丽[16]等在绿巨人(Spathiphyllumkochii)组培中研究了青霉素钠、先锋霉素和庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果，结果表明先锋霉素的抑菌效果最好，青霉素钠和庆大霉素次之。周蒋陈[17]等在水生鸢尾继代培养中发现防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠对内生菌污染有抑制作用，其中0.5 %浓度以内的苯甲酸钠效果最好。

从系统发育树(图4)来看，LM85与B.thuringiensis聚在同一系统发育分支，与生理生化鉴定结果一致；LM53与B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一系统发育分支，无法将其鉴定到种，只有结合生理生化指标结果，才能将LM53鉴定为B.licheniformis。由此可见，基于16S rDNA序列分析的系统发育学研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更适用于属以上分类单元，对于属以下分类单元分辨率明显低。在某些近缘种的鉴定中，如芽孢杆菌属中解淀粉芽孢杆菌近缘种，很难精确确定它们的分类地位。因此只有有效地将细菌经典分类学和现代分子分类学进行结合，将表型鉴定和分子生物学鉴定综合分析才能得出更为可靠的结论。

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(责任编辑 王家银)

Isolation and Identification of Pollution Bacteria during Tissue Culture of Blueberry

JIN Song1,2, YIN Li-fang1*, XIA Ti-yuan1**, LI Bing3, XU Sheng-guang1,REN Zhen1, ZHANG Yong-fu1, NIU Yan-fen1, LIU Yi-ming1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 3.Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

The pollution bacteria during tissue culture of blueberry were isolated and identified so as to provide scientific references for pollution prevention during its tissue culture. Using the NA culture medium to isolate the strains, the bacterial species were identified by morphology, physiological and biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The sequences analysis of 16S rDNA indicated that the strain LM53 had the same embranchment with theB.amyloliquefaciens(HQ727971),B.vallismortis(FJ386541),B.licheniformis(EF644414),B.subtilis(AY583216) in the phylogenetic tree with the homology of 99.9 %-100 %. The strain LM85 had the same embranchment with theB.thuringiensis(ACNF01000156) in the phylogenetic tree with the homology of 99.7 %. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain LM53 matched the descriptions ofB.licheniformis, the strain LM85 matched the descriptions ofB.thuringiensis. The LM53 strain was identified asB.licheniformisand the LM85 strain was identified asB.thuringiensis.

Blueberry; Tissue culture; Pollution; Bacteria; Isolation; Identification

1001-4829(2016)11-2692-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.033

2015-03-26

云南省都市特色农业工程技术研究中心项目(TSNY0201);昆明学院大学生项目(XJD15055);昆明学院人才引进基金项目(YJL12010);昆明学院校立重点基金项目(XJL12020);云南中烟品牌省内原料产地生态与主栽品种合理布局研究项目;云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目资助

靳 松(1984-)，男，云南昆明人，硕士，讲师，主要从事园艺植物组织培养的教学及科研工作，E-mail:ibmjs@163.com，*为并列第一作者，**为通讯作者，E-mail:xiatiyuan@sohu.com。

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