畜禽DNA甲基化研究进展

林威敏　肖天放*　福建农林大学动物科学学院　福州　350002

畜禽DNA甲基化研究进展

林威敏肖天放*福建农林大学动物科学学院福州350002

基因组甲基化是通过甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，是表观遗传学的重要组成部分，对许多生理活动具有重要影响。文中主要从甲基化在畜禽上的研究进展，以及近几年在长链非编码RNA等研究进展，概述DNA甲基化研究的发展。

甲基化表观遗传学畜禽

表观遗传学是指DNA序列无变化的、可遗传的基因表达改变。其中，DNA甲基化是表观遗传学中一个重要的修饰形式［1］。基因组水平的DNA甲基化是在 DNA甲基转移酶 （DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸（adenosine methionine sulfur，SAM）作为甲基供体，将一个甲基添加到胞嘧啶的5′-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）［2］。DNA甲基化对于许多生理过程包括遗传、繁殖、发育以及疾病等方面具有重要的影响。文中主要从动物生产方面尤其是畜禽生产方面，对DNA甲基化研究进展进行整理概括。

1　畜禽DNA甲基化的研究概况

1.1DNA甲基化酶系统DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）是DNA甲基化的主要催化因子。目前在哺乳动物中，常见的DNMT有Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L［3］，其中对DNMT系统中Dnmt2的研究获得了大量成果。其广泛分布在各种生物中，包括哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫、植物、真菌等［4］。虽然Dnmt2对DNA甲基化作用的研究仍然没有一个广泛被认可的结论，但是现有的认识主要集中在以下几点：（1）Dnmt2不是一种DNA甲基化酶，而是一种RNA甲基化酶；（2）Dnmt2具有广泛的内源RNA甲基化活性，并且在表观遗传中起重要作用［5］；（3）Dnmt2有可能是古老的病源防疫机制的因子之一［6］。此外，有研究表明，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在低氧环境下对于小鼠大脑皮质具有重要的保护作用。其对DNA甲基化的催化作用，对机体的正常生理维护具有重要作用［7］。

1.2DNA甲基化生物学作用DNA甲基化参与多种生命调节形式，对正常生理调控起着重要作用。

1.2.1参与基因的表达调控大量研究表明，无论是在启动子区域的CpG岛中，亦或是基因内部，DNA的甲基化水平越高，基因的表达越少，呈现一种明显的负相关关系。较低的甲基化水平，却与转录活性呈正相关关系，对基因的转录、染色体构型等方面产生影响，进而影响基因的表达［8］。有观点认为，甲基化有利于异常染色质的生成，对机体的遗传发育产生影响。

1.2.2对发育分化产生影响生物发育过程中，基因的序列是不变的。但是在个体发育的不同时期，基因的表达却是有相对规律性的；相关的基因与DNA甲基化关系密切。胚胎阶段，通过DNA的甲基化与去甲基化，形成新的甲基化模式，并且能够产生具有发育潜质的细胞［9］。甲基化对机体正常发育起到重要作用。

1.2.3DNA甲基化与基因组印记哺乳动物性细胞形成或产生合子时，亲本基因产生专一性修饰，使后代体细胞源于亲本的基因表达活性差别不同，这就是基因组印记。研究表明，产生这种情况的主要原因是因为亲本等位基因被甲基化造成的［10］。

1.3DNA甲基化检测方法DNA甲基化常用的检测方法主要分为全基因组DNA甲基化水平检测与DNA甲基化位点检测。

1.3.1全基因组DNA甲基化检测常用的全基因组DNA甲基化检测方法往往有：（1）酶切法：常用的甲基化限制性内切酶有HapⅡ、MspⅠ、NotⅠ、Bst UⅠ等。利用这些限制性内切酶对5mC端的敏感性差异，可以把那些没有甲基化的基因组DNA切成小片段，而甲基化的基因组DNA则不受影响。往往酶切法可以将甲基化片段切割为大小不一的片段，然后再进行检测，这种方法操作简便，成本低，效果显著。但是会出现假阳性现象，干扰结果［11］。（2）免疫共沉淀即亚硫酸氢盐转换法：由于酸性亚硫酸盐可以使未甲基化的胞嘧啶（C）脱氢基变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（C）则不受影响。之后利用PCR对处理过后的DNA模板链进行扩增，胸腺嘧啶（T）与处理得到的尿嘧啶（U）互补。在测序中由于亚硫酸盐处理过后的DNA链（克里克链 BSC）与互补链（沃森链BSW）无法互补，就出现四种不同的序列。经过片段分离，检查出甲基化的胞嘧啶（C），利用芯片或是大规模测序可以获得所需要的结果。但是亚硫酸转化法会出现C/T不匹配的问题，需保证完全配对，而且工作量较大。

目前新一代甲基化检测方法有全基因组亚硫酸氢钠测序法 （whole-genome shotgun bisulphate sequencing，WGBS），是可以完全实现全基因组单碱基分辨率的甲基化检测方法。该方法多用于多组织、多样本的DNA甲基化检测。但是该方法也存在费用昂贵且经亚硫酸盐处理过的序列复杂度降低等问题［3］。

另外还有其他性价比较为可观的方法，包括限制性内切酶的测序方法 （MRE-Seq）［12］、5-甲基胞嘧啶单克隆抗体的测序方法（MeDIP-Seq）以及简化过的亚硫酸氢钠测序技术（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）等［13］。

1.3.2DNA甲基化位点检测某个DNA甲基化位点的检测方法一般采用以下方法：（1）亚硫酸氢盐测序PCR（Bisulfite sequencing PCR，BSP）或是甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）等方法，均利用亚硫酸盐对未发生甲基化的胞嘧啶（C）进行脱氢作用，再利用PCR对处理过的序列进行扩增，判断是否发生甲基化。这两种方法准确度高，但也存在费时费力的问题。（2）甲基化位点特异性结合的层析法，利用与甲基化特异性结合的蛋白，使之与甲基化位点特异性结合。一般是把特异结合蛋白的一端和凝胶结合，另一端则暴露出来，用于检测DNA片段上的甲基化位点，甲基化的DNA就可以被特异性结合蛋白检测出。（3）荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR）：利用经过亚硫酸盐处理过的甲基化片段可与设计的探针序列特异性结合的特点，在探针的5'末端连接一个报告荧光基团（比如FAM），在其3'末端连接一个淬灭荧光基团（比如TAMRA），之后进行PCR扩增。如果探针可与DNA片段杂交，由于Taq DNA聚合酶的作用，5'末端的荧光基团被切下，而失去了淬灭荧光基团的抑制，就会出现荧光现象。通过每次循环荧光的强度测定，就可以得到DNA甲基化的强度［14］。这种方法操作简单，灵敏度较高，但是也存在易受环境影响，不能得到较完全的甲基化信息的不足。

1.4DNA甲基化在畜禽上的研究进展DNA甲基化在畜禽生产上的研究也已经取得大量成果。

在乳牛上的DNA甲基化研究，主要集中在相关的乳牛生产及疾病预防中，有研究表明，乳牛金黄色葡萄球菌性乳房炎能够促使乳腺组织DNA再甲基化，DNA再甲基化可能是乳牛乳房炎急性期的一种普遍调控［15］。另外，根据已有的研究可知，烯脂酰辅酶A水合酶短链1（enoyl-CoA hydratase short chain 1，ECHS1）的表达对机体的正常生长发育有着重要的维持作用。因此，王凤武等利用BS-Seq方法检测了ECHS1的甲基化模式图，得到在荷斯坦乳牛459 bp的ECHS1片段中有28个CpG位点，其中多个位点对β-氧化有重要的调控作用［16］。

在试验小鼠的研究过程中，Lee Y M等通过应用DNA甲基化转移酶制剂5-aza-dC（5-aza-2'-deoxycytidine，10 μmol/L～5 μmol/L）对小鼠胚胎进行实时定量（Q-PCR）处理，得到5-aza-dC干预修饰微小RNA（microRNA）的概况，以及在小鼠桑椹胚至囊胚阶段对象识别提供信息，用来探索生育以及microRNA的调控和表观遗传干预之间的关系［17］。

对于猪的DNA甲基化研究，李明洲等构建了猪的脂肪和肌肉DNA甲基化图谱，因为猪是一种和人类生理活动十分接近的模式动物，除了可以获得不同部位的猪肉脂肪沉积的差异，还可以为人类破解肥胖问题提供相应的基础型数据，具有重大的参考价值［18］。另外，白小青等人以荣昌猪为实验动物，利用HPLC法检测了不同体重，阉割后荣昌猪的心脏、肝脏、横膈膜三种组织中的基因组DNA的甲基化水平，结果显示不同体重对基因组DNA甲基化具有重要影响［19］。借鉴了小鼠成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的研究，魏可等研究了35日龄猪胎儿的干细胞多能性相关基因启动子区域甲基化情况，结果显示体细胞重编程为iPSCs的过程伴随着多能基因启动子甲基化程度的降低，为理解iPS重编程中多能性相关基因的DNA去甲基化过程和了解控制多能性相关基因的表观遗传调节提供基础［20］。

另外，根据研究得知，不同年龄的仔猪，其抗原处理相关转运体1（Transported associated with antigen processing，TAP1）基因的启动子区域，存在三个潜在的调控位点，分别是 CpG-4、CpG-13以及CpG-15，对TAP基因的甲基化具有一定的调控作用。另外，TAP1基因启动子区域CpG岛甲基化对TAP1的表达具有负相关作用 （P＜0.05），其mRNA的表达随着日龄的增加而增加。进而随着日龄增加，影响TAP1蛋白，从而对仔猪的肺水肿与腹泻产生影响［21］。

另外根据Dong W等人的研究，利用重亚硫酸盐测序PCR（Bisulfite Sequencing PCR）和荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR）分别对CpG岛中 TAP1（Transported associated with antigen processing，TAP）基因启动子的甲基化状态和从出生到断奶年龄的苏太仔猪空肠的TAP1基因的表达进行研究，方差分析显示，不同年龄对于CpG岛中的甲基化水平具有显著性影响（P＜0.05）［21］。

最近的一些有关甲基化的研究已经开始集中在对于一些不表达的但是有证据显示对机体的正常生理活动具有重要意义的基因组，即非编码基因。长链非编码RNA（lncRNAs）是基因组中一个主要的未开发的基因组件，能够对X染色体的沉默，染色质修饰，转录激活，转录干扰核内运输等多种重要的调控产生影响。周等人通过已知的甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq），利用民猪和长白猪重新构建猪脂肪和肌肉中的lncRNAs甲基化模式。表明，不同日龄间民猪与大白猪背标甲基化存在差异；民猪和大白猪在150和180日龄之间出现去甲基化现象，其次是在180和210日龄［22］。该结果有助于理解lncRNAs基因参与脂肪沉积与肌肉发育的作用。

另外还有新的研究指出，不同浓度的微量元素对于基因组中的甲基化具有一定的影响。根据Karweina D等以54头仔猪为实验对象，随机分为三组，只对锌浓度进行分梯次控制的研究。结果表明DNA甲基化作为一种ZIP4（ZRT，IRT-like protein，ZIP）基因维持锌平衡的调控机制，ZIP4基因甲基化对高浓度的锌（Zin）的调控效果很低，但可能影响替代锌反应转录因子的结合［23］。

2　甲基化的发展趋势

随着表观遗传学的发展，人们探究甲基化的步伐将继续深入。已知的研究中，对于甲基化的作用机理已经有了一定的认识，但是这些认识还是十分浅显的。今后的研究中，关于甲基化和人类疾病之间的相互关系，将仍然会是一个热门的研究方向。甲基化的检测将成为作为人类疾病的诊断的一种手段。尤其是在人类早期癌症的诊断上，具有重要的作用。一般来说，人体的原癌基因因为各种作用被限制，其中就有甲基化作用，抑制了原癌基因的表达。同时，抑癌基因充分表达，提高机体自身的抑癌机制。但是，原癌基因会因为某些原因，包括环境与生理原因，出现去甲基化现象，导致原癌基因被激活。然而，抑癌基因却出现甲基化现象，从而导致癌症的发生。研究表明，当机体的总体甲基化水平下降，而个别位点的甲基化水平明显上升时，往往是早期癌症发生的信号。基于此，甲基化水平的检测可以成为人类疾病的一种有效的诊断方式，提高人类的健康水平。

同时，长链非编码RNA（lincRNAs）的甲基化与去甲基化对于相关疾病的影响，也是一个重要的研究热点。已经获得的研究成果表明，一些lincRNAs的甲基化调控，可以作为某些癌症辅助治疗的潜在靶点，例如HOTAIR［Homeobox（HOX）transcript antisense RNA］，可以作为小细胞肺癌耐药性的辅助靶点［24］。

此外，也有一些学者已经开始着手于将全基因组关联分析 （Genome-Wide Analysis Study，GWAS）技术应用于甲基化的研究，将整个个体的全基因组作为一个研究对象，不再着眼于某一个或是某几个基因组的甲基化对于某种特定的生理状况作用的研究。此外，根据已经完成的某些物种的de novo测序结果，筛查出具有潜在甲基化的区域，进一步研究该区域对于个体具体的生物学作用。

3　问题与展望

基因组甲基化作为表观遗传学的重要组成部分，在近些年的发展中，已经取得了较为丰富的成功。但是，关于甲基化对机体具体的生理功能的作用机制与产生原因仍然不是十分清楚，依旧不能提供较为深入的解释。例如各种人类癌症中，为什么原癌抑癌基因会出现甲基化与去甲基化？环境与生理原因的对甲基化与去甲基化的作用机理是什么？甲基化与去甲基化二者之间相互转化的作用机制是什么？控制机体产生甲基化现象的基因又在哪里？它的作用机理又是什么？这些问题都还没有具体的研究成果。因此，今后的甲基化研究将继续深入探讨相关生理活动包括疾病的发生与作用机制。同时，对于非编码RNA对于DNA甲基化的作用，也将进一步深入。此外，在动物生产方面，也将为动物育种饲养等方面提供理论基础，为人来带来新的经济效益。

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Research progress on DNA methylation of livestock and poultry

LinWeimin XiaoTianfang*
（College of animal science，Fujian agriculture and forestry university，Fuzhou 350002）

Genome methylation is an important parts of Epigenetics，through methyltransferase catalyzes the Cytosine to the 5-methylcytosine，and significantly effects on many bioactives.This paper summarizes the developments in study of DNA methylation，during the progress in the study of methylation in livestock，and long noncoding RNA in recently years.

Methylation Epigenetics Livestock and poultry

A

1003-4331（2016）04-0035-04

科技部科技基础性工作专项（2014FY120800）资助。

林威敏（1992-），男，研究生。E-mail：
957760184@qq.com。
*

肖天放（1964-），男，教授。E-mail：tfxiao@163. com。