林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

康 强，周 鑫，罗 燕，田 青，程建国，赵 位

(1 四川农业大学 a 森林资源保护与利用实验室，b 微生物学实验室，c 动物医学院，四川 都江堰 611830；2 四川养麝研究所，四川 都江堰 611830)



林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

康 强1a，周 鑫1b,1c，罗 燕1b，田 青1b,1c，程建国2，赵 位1b,1c

(1 四川农业大学 a 森林资源保护与利用实验室，b 微生物学实验室，c 动物医学院，四川 都江堰 611830；2 四川养麝研究所，四川 都江堰 611830)

【目的】 探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性，为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】 采集林麝粪便，采用改良的CTAB抽提基因组DNA；按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cytb基因进行扩增测序后，用DNAMAN 6.0软件进行系统发育分析；在不同温度存放不同时间，研究林麝粪便基因组DNA的提取与mtDNA D-loop区和Cytb基因PCR扩增的时效性。【结果】 以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增均能特异性地扩增出mtDNA D-loop区和Cytb基因。系统发育分析结果表明：所扩增产物为林麝的mtDNA D-loop区和Cytb基因。时效性分析结果显示：常温和4℃条件下保存96 h以内的林麝粪便所提取的基因组DNA能有效扩增出mtDNA D-loop区和Cytb基因。【结论】 自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA保存时间较长，通过在野外采集林麝粪便提取基因组DNA并进行物种鉴定是可行的。

林麝；粪便；线粒体DNA；D-loop区；Cytb基因

林麝(Moschusberezovskii)是我国一级保护动物，已被列入CITES附录Ⅰ中[1]。林麝是典型的林栖动物，多栖居在海拔2 000～3 800 m的针阔混交林和阴暗针叶林内，其嗅觉和听觉都比较发达，但性情胆怯常在黄昏后或拂晓时分进行活动[2]。因此，在对野外林麝的行为生态学和分子进化遗传学等研究中，通过直接捕获动物获取用于分子生物学相关研究的材料较为困难。近年来，在对野生动物进行保护研究时，人们常采用不触及或不伤害动物体本身，通过收集其掉落的毛发和排放的粪便等非损伤性取样方法进行采样[3]。而在所有的非损伤性取样中，收集粪样对动物是干扰最小且最容易收集的。随着分子粪便学的发展，利用粪样来提取基因组DNA，具有巨大的潜在应用价值[4]。

目前粪便基因组DNA提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、Chelex-100 煮沸法、硫氰酸胍裂解法、淀粉吸附法以及商业试剂盒法等[5-6]。但因各种动物食性的差异及粪便所在野外环境的不同等因素影响，不同动物粪便基因组DNA的提取常选取不同的程序[7]。2003年，钟华等[8]采用预处理-酚/氯仿抽提法对大熊猫粪便DNA提取方法进行了改进，使所提DNA的PCR扩增变得更加容易。2004年，张保卫等[9]采用自创改进方案从大熊猫和小熊猫粪便中提取到高质量的DNA，能有效进行相关基因扩增。2008年，刘宇庆等[10]根据狗獾的食性特征结合多种粪便DNA提取方法优化了狗獾粪便DNA提取方案。近年来，国内外在对林麝进行遗传学分析或系统发育分析时，已采取多种方式进行基因组DNA的提取。2011年，冯慧等[11]对20世纪50年代左右林麝熟制标本皮张DNA进行了提取，通过对Cytb基因的扩增分析证实，尽管DNA提取物中DNA含量较少，但其线粒体DNA保存较好，能够扩增出特异性条带。2012年，白康等[12]通过PCR仪法对采集的林麝毛发样本进行基因组DNA提取，得到的DNA浓度高、纯度好，PCR产物条带清晰、位置正确。目前，采用粪便为材料提取林麝基因组DNA的报道较少。

本研究结合多种粪便基因组DNA提取方法[13-16]，对林麝粪便基因组DNA提取方案进行优化，通过对线粒体的保守区域Cytb基因[17]以及进化最快的D-loop区[18-19]进行PCR扩增,验证该方法的可靠性；另外，通过设置温度差异性处理和时间间隔变量，再进行mtDNA D-loop区和Cytb基因的扩增，探索了不同温度与时间下粪样扩增mtDNA D-loop区和Cytb基因的变化情况，对林麝野外调查工作以及分子粪便学在物种鉴定和林麝保护中的应用具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 林麝粪样 林麝粪便样品采自四川养麝研究所白沙养麝场和马尔康养麝场，各10份，粪样的采集在林麝便后数分钟内进行。林麝新鲜粪样用无菌自封袋采集，做好标记后迅速放入有冰袋的冰盒中带回实验室，4 ℃保存。

1.1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、10×TaqDNA Reaction Buffer、dNTPs、DNA Marker (DL2000)、Gold View、普通产物纯化试剂盒(DP204)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)等，均购自天根生物有限公司。

1.2 林麝粪样mtDNA D-loop区和Cytb基因扩增引物

根据 NCBI上提供的林麝Cytb基因全碱基序列，用primer premier 5.0 软件设计Cytb基因引物；mtDNA D-loop区PCR扩增引物参见文献[20]。2对引物均由上海生工生物技术有限公司合成，其相关信息见表1。

表 1 mtDNA D-loop区和Cyt b基因的PCR引物序列

1.3 林麝粪样基因组DNA的提取

林麝粪便基因组DNA的提取按如下方法进行。(1)取林麝粪便6～7粒(约600 mg)于5 mL离心管中，用镊子将其夹碎，加入2 mL 0.9%的生理盐水，间歇振荡1 min至样本混匀，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液。

(2)向沉淀中加入2 mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解缓冲液(CTAB 55 mmol/L， NaCl 1.4 mol/L，pH 8.0的Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0的EDTA 20 mmol/L)振荡混匀30 s，置65 ℃水浴2 h。

(3)将上述裂解液涡旋15 s，12 000 r/min 离心4 min，转移上清液1.5 mL至新的5 mL离心管，等体积加入饱和酚-氯仿-异戊醇(V(饱和酚)∶V(氯仿) ∶V(异戊醇)=25∶24∶1)间歇振荡10 min，12 000 r/min 离心10 min。取上清液至新的5 mL离心管重复该步骤1次。

(4)取上清液按10∶1∶20的体积比分别加入上清液、3 mol/L NaAc和冰预冷无水乙醇，温和地上下翻转数次，混匀后置-20 ℃冰箱1 h。

(5)将(4)的提取液12 000 r/min 离心10 min，弃上清，加入1 mL 体积分数70%的乙醇溶液，用移液器轻轻吹打混匀，12 000 r/min 离心2 min，弃上清，室温放置数分钟至沉淀干燥。加入200 μL TE 缓慢混匀溶解沉淀，最后用普通产物纯化试剂盒进行纯化，得到的林麝粪便基因组DNA置-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 林麝粪样mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增与测序分析

以提取的林麝粪便基因组DNA为模板，以F1/R1与F2/R2为引物分别进行mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增。PCR扩增采用50 μL反应体系：10×TaqDNA Reaction Buffer 5.0 μL，上、下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，2.0 UTaqDNA聚合酶，基因组DNA 1 μL，最后加ddH2O补足至50 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶(电压80 V)电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)回收目的片段后送生工(上海测序部)测序。

林麝粪样mtDNA D-loop区和Cytb基因PCR扩增测序结果用Blast在NCBI上进行比对分析，用DNAMAN 6.0软件进行系统发育树的构建。其中选取林麝(Moschusberezovskii)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、马鹿(Cervuselaphus)、梅花鹿(Cervusnippon)、驯鹿(Rangifertarandus)、牛(Bostaurus)相关序列进行mtDNA D-loop区系统发育树构建；选取赤麂(Muntiacusmuntjak)、马鹿(Cervuselaphus)、大角鹿(Megalocerosgiganteus)、马麝(Moschuschrysogaster)、安徽麝(Moschusanhuiensis)、林麝(Moschusberezovskii)、黑麝(Moschusfuscus)、喜马拉雅麝(Moschusleucogaster)、山羊(Caprahircus)、捻角山羊(Caprafalconeri)、长颈羚(Litocraniuswalleri)、东高加索羱羊(Capracylindricornis)、大角驴羚(Kobusmegaceros)、黑驴羚(Kobuslechesmithemani)相关序列进行Cytb基因系统发育树构建。

1.5 林麝粪样mtDNA D-loop区和Cytb基因PCR扩增的时效性

先将20份林麝粪便分别编号为1～20,然后将其各分出一半分别对应编号为1′～20′。接着将样品1～20置于4 ℃保存，样品1′～20′置于室温保存(10～20 ℃，平均相对湿度70%)。在保存期间每隔12 h分别随机取样进行基因组DNA提取以及mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增，观察电泳结果。

2 结果与分析

2.1 林麝粪便mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增

以提取的林麝粪便基因组DNA为模板进行mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增，凝胶电泳结果显示两者PCR扩增条带皆与目标条带预期大小一致(图1)。PCR产物测序后将测序结果提交至NCBI并进行Blast比对，结果显示测序序列分别与林麝的mtDNA D-loop区和Cytb基因序列具有很高的同源性(≥99%)，即所扩增基因均为目的基因。

2.2 林麝粪样mtDNA D-loop区和Cytb基因扩增序列分析

mtDNA D-loop区和Cytb基因各自的系统发育树构建结果如图2和图3所示。从林麝粪样Cytb基因系统发育树图(图3)可以看出，本研究中测定的Cytb基因序列(FMD1_Cyt_b)在系统发育树上同时与马麝、安徽麝和林麝有着很近的进化距离，单从Cytb基因序列无法进行具体的种属鉴定。但从林麝粪样mtDNA D-loop区基因系统发育树图(图2)可以看出，所扩增序列与鹿科的马鹿、梅花鹿等有着明显的分支，而与麝属的林麝、安徽麝有着明显的聚类趋势，并且与林麝有着很近的进化距离，因此可以特异性地判定所扩增序列为林麝mtDNA D-loop区序列。

M.DNA Marker(DL2000)； 1.林麝粪样扩增产物

图 2 林麝粪便mtDNA D-loop区系统发育树图

图 3 林麝粪便Cyt b基因系统发育树图

2.3 林麝粪便mtDNA D-loop区和Cytb基因的时效性

林麝粪样在不同条件(4 ℃和室温)下保存，每隔12 h分别随机取2份同一样品不同温度处理的粪便样品进行基因组DNA提取与mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增，电泳结果如图4和图5所示。从图4和图5可知，林麝粪便在4 ℃及常温处理条件下，于96 h内都能够特异扩增出mtDNA D-loop区和Cytb基因序列，说明林麝粪便可以在常温条件下有效保存较长时间。

M.DNA Marker (DL2000)；1～8.依次为排便后12,24,36,48,60,72,84,96 h 样品扩增产物 Samples

3 讨 论

本研究对林麝粪便样品提取基因组DNA并进行了mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR扩增，提取的20份林麝粪便基因组DNA都扩增出了这2个基因，说明从林麝粪便中提取基因组DNA并进行分子检测的成功率较高；同时，时效性研究结果表明，林麝粪便可以在常温条件下有效保存较长时间，说明分子粪便学在林麝野外采样调查工作中的应用是可能的。

在利用mtDNA D-loop区与Cytb基因进行系统发育树构建以鉴定动物种属关系时，单一的分子鉴定结果有时并不能很好地进行物种鉴定，需要结合多种分子鉴定结果进行物种的精细定位。彭红元等[21]结合线粒体Cytb、16S rRNA等基因对麝的分子系统进化地位进行了再研究，结果表明在不同基因以及序列长度分析中，不同的物种数目及分析方法对研究结果产生明显影响。

粪便基因组DNA的提取方法有多种，常规的有硫氰酸胍裂解法、Chelex-100 煮沸法和酚-氯仿抽提法等[7]。林麝为植食性动物，其粪便中含有大量的植物残渣、消化液、色素、胆盐、蛋白等杂质，针对其植食性特点本试验设计并利用基于CTAB法并结合产物纯化回收试剂盒来提取林麝粪便基因组DNA。由于林麝粪便中本身含有大量的肠壁脱落细胞、微生物细胞以及植物细胞等，所以提取的粪便基因组DNA为林麝肠道脱落细胞基因组DNA、肠道微生物基因组DNA以及其他未消化植物残渣基因组DNA的混合物。从本研究中mtDNA D-loop区和Cytb基因的PCR结果来看，所扩增出的目的条带单一，大小准确，序列NCBI比对结果吻合，说明背景DNA物质对其PCR效果干扰很小，适合用于林麝物种鉴定。本研究试验前期在对林麝粪便进行基因组DNA提取时林麝粪便用量较少，结果未能很好地扩增出mtDNA D-loop区和Cytb基因，这可能是由于粪便中消化道脱落细胞含量较少，而且遗传物质会存在一定的降解；之后增加了林麝粪便用量，所提取基因组DNA的PCR扩增效果得到了较大改善。在野外调查工作中，工作人员通常以动物毛发、粪便形状、活动痕迹等外观性状对动物进行分类，而在野生环境中很多动物尤其是亲缘性较近的种其形态特征、生活习性十分相近，仅仅依靠野外观察往往难以确定一个生态系统中的物种组成以及它们之间的演替关系。林麝生性胆小懦怯，对周围环境变化十分敏感，传统的如血液、毛发等采样方法对林麝应激较大，而粪便采集对林麝的影响较小。同时，该研究证明从林麝粪便中可提取基因组DNA，且能够通过粪便基因组DNA的遗传信息特异性分析动物种属进化关系等。因此分子手段的加入定能使野外调查工作更加准确高效。

4 结 论

本研究采用改良CTAB法对常温和4 ℃条件下保存96 h内的林麝粪便进行基因组DNA的提取，所提取的基因组DNA能有效扩增出林麝自身基因组mtDNA D-loop区和Cytb基因。该研究表明在自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA有较长的保存时间，通过采集野外林麝粪便进行基因组DNA的提取并进行物种鉴定的方法是可行的。

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Extraction and PCR amplification of genomic DNA of forest musk deer feces

KANG Qiang1a,ZHOU Xin1b,1c,LUO Yan1b,TIAN Qing1b,1c, CHENG Jianguo2,ZHAO Wei1b,1c

(1 aLabofForestResourceProtectionandUtilization,bLabofMicrobiology, cCollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity,Dujiangyan，Sichuan611830，China; 2SichuanInstituteofMuskDeerBreeding,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

【Objective】 This study explored the feasibility of genomic DNA extraction and species identification from forest musk deer feces to provide scientific basis for field investigation and application of deer molecular scatology in protection of forest musk deer.【Method】 Genomic DNA of forest musk deer feces was extracted by the modified CTAB extraction method.Cytbgene and mtDNA D-loop region were amplified by PCR.Both sequences were analyzed by DNAMAN 6.0 software.The timeliness of genomic DNA extraction and PCR amplification of mtDNA D-loop region andCytbgene was investigated at different temperatures.【Result】 Genomic DNA of forest musk deer feces could be extracted,and the phylogenetic analysis showed that both mtDNA D-loop region andCytbgene could be amplified.Timeliness analysis showed that mtDNA D-loop region andCytbgene could be specifically amplified within 96 h at both room temperature and 4 ℃.【Conclusion】 The DNA of musk deer in feces can be preserved at a long time under natural conditions.It is feasible to conduct species identification by collecting forest musk deer feces in the wild.

forest musk deer;feces;genomic DNA;D-loop region;Cytbgene

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.001

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.002.html

2015-06-04

四川省林业厅省级自然保护区重点物种科学研究项目；四川农业大学院级专项

康 强(1963-)，男，四川彭州人，副教授，本科，主要从事森林资源管理及保护研究。E-mail：283755855@qq.com

罗 燕(1974-)，女，四川都江堰人，教授，博士，主要从事野生动物保护及病原微生物与分子生物学研究。 E-mail：lycjg@163.com

S865.4+1

A

1671-9387(2016)11-0001-07