三个道地产区丹参混合提取物对大鼠脑缺血再灌注后bc1-2、bax表达的影响*

2016-12-15李红刚王红鸽聂晓枫陈卫银陕西省渭南职业技术学院渭南714000

陕西中医 2016年11期

李红刚王红鸽聂晓枫孙陈卫银陕西省渭南职业技术学院(渭南714000)

目的：通过观察四川、山东、河南三个道地产区丹参混合提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织bc1-2和bax蛋白表达的影响，探讨三产区丹参对神经细胞凋亡的影响。方法：采用颈内动脉线栓加环扎法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，再灌注24h后各组bc1-2和bax蛋白的表达采用免疫组化法检测。结果：再灌注24h后，模型组脑内损伤区周围bcl-2的表达明显增加(P<0.05)，三产区丹参组均能明显上调bcl-2的表达，与模型组比较有显著差异(P<0.05)，其中山东丹参组上调的幅度最大，与河南、四川丹参组比较有显著差异(P<0.05)，河南、四川丹参组比较无显著差异(P>0.05)；再灌注24h后，模型组脑内损伤区周围bax的表达显著增加(P<0.01)，三产区丹参组均能明显降低bax的表达，与模型组比较有显著差异(P<0.01)，其中四川丹参组降低的幅度最大，山东丹参组次之，河南丹参组降低的幅度最小，三组比较均有显著差异(P<0.05)。结论：三个道地产区丹参混合提取物均能通过上调bcl-2表达，降低bax的表达，从而抑制神经细胞凋亡，发挥脑保护作用。不同产区丹参混合提取物对各指标表达影响不同，其原因可能与不同产区丹参混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶点不一致有关。

丹参是常用活血化瘀药，其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的影响报道较多，但查阅文献，未见不同产地丹参对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型影响的报道。本研究选取四川、河南、山东三个道地产区丹参混合提取物，旨在观察不同产区丹参对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织bc1-2、bax表达的影响，从而探讨其对神经细胞凋亡的影响。

1 材料和方法 1.1 动物健康SD大鼠60只(购于四川大学)，合格证号：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，体重275.25±24.28g，清洁级，鼠龄7～8周。

1.2 药品与试剂采取四川中江古店、山东沂南、河南方城栽培丹参根10kg，样品采集后快速运回实验室，经加工处理后，干燥成药材，由成都中医药大学药学院提取制成0.4g/ml生药的供试品溶液。兔抗大鼠bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠bax单克隆抗体 ( 购买自北京博奥森生物技术有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗体(购买自北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.3 造模及分组大脑中动脉闭塞(MCAO)模型制备方法，采用颈内动脉线栓加环扎法。将60只大鼠按数字随机法分为：正常组、假手术组、模型组、四川丹参组、山东丹参组、河南丹参组，每组10只。正常组：不给予任何干预措施；假手术组：先切开右侧颈部皮肤，然后暴露右侧颈总动脉分叉，随后再缝合皮肤，术前5d生理盐水灌胃，1次/d，术后2h生理盐水再灌胃1次；模型组：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d生理盐水灌胃，1次/d，再灌注后2h时生理盐水再灌胃1次；四川丹参组、山东丹参组、河南丹参组：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d分别予四川、山东、河南丹参混合提取物灌胃，1次/d，再灌注后2h再灌胃1次。再灌注24h后处死大鼠。根据人与动物用量体表面积换算法计算，实验中丹参混合提取物的灌胃剂量为6.75ml/kg。

1.4 HE及免疫组织化学检测方法病理组织切片标本收集及处理：实验各组SD大鼠，再灌注后24h灌注取脑并固定，固定72h后做成石蜡切片，每个标本各取1张用于HE染色。应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法进行，一抗为兔抗大鼠bcl-2、bax单克隆抗体，二抗为生物素化羊抗兔IgG抗体,封片后再采用光镜观察。阳性细胞计数和统计学分析:免疫组化染色结果拍照后进行半定量分析，并计算阳性细胞的积分光密度值IOD。采用SPSS19.0进行数据统计，采用单因素方差分析比较各组间数据，以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为极显著统计学差异。

2 结果 2.1 各组脑组织光镜下的HE染色结果如图所示，正常组和假手术组细胞与间质之间界限清楚，细胞核完整，核仁清晰；模型组细胞与间质之间界限不清楚，大部分组织细胞坏死，多数细胞溶解呈空泡状，可见核固缩和核碎裂；三产区丹参各组脑组织细胞坏死程度较模型组轻，可见少量细胞核固缩及溶解，部分胞质液化。

2.2 免疫组化染色的结果 2.2.1 bcl-2蛋白免疫组化染色的结果:正常组和假手术组脑内bcl-2表达较少，二者无显著差异；模型组脑内损伤区周围bcl-2的表达增加，与正常组、假手术组比较P<0.05；三产区丹参组均能明显上调脑内损伤区周围bcl-2的表达，与模型组比较P<0.05；山东丹参组上调脑内损伤区bcl-2的幅度最大，与河南、四川丹参组比较有显著差异P<0.05，河南、四川丹参组比较无显著差异P>0.05，见表1。免疫组化染色见图2。

A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：河南丹参组；E：四川丹参组；F：山东丹参组

表1 各组Bcl-2的IOD值

2.2.2 bax蛋白免疫组化染色结果：正常组、假手术组脑内bax表达较少，二者无显著差异；模型组脑内损伤区周围bax的表达显著增加，与正常组、假手术组比较P<0.01；三产区丹参组均能明显降低脑内损伤区周围bax的表达，与模型组比较P<0.01；四川丹参组降低脑内损伤区周围bax的幅度最大、山东丹参组次之，河南丹参组降低的幅度最小，山东、河南丹参组与四川丹参组相比P<0.01，河南丹参组与山东丹参组相比P<0.05，见表2。免疫组化染色见图3。

表2 各组Bax的IOD值

A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：四川丹参组；E：山东丹参组；F：河南丹参组

3 讨论 3.1 缺血性脑血管病与活血化瘀缺血性脑血管病属于中医“中风”范畴，对中风病因病机的认识,历代医家一般认为不外乎与瘀、虚、火、风、痰有关。其中瘀阻脑络是卒中的病理基础[1]，血蓄于脑是卒中病的病理中心，血瘀证候存在中风病各证型和阶段之中。所以，活血化瘀是治疗中风的基本治法。目前，活血化瘀药多种制剂已广泛应用于临床治疗脑血管病[2]，且疗效较为满意，同时对活血化瘀药治疗卒中的机理研究也在不断深入。

3.2 脑缺血再灌注与细胞凋亡脑缺血再灌注(Cerebra ischemia and reperfusion，CIR)是指脑缺血一段时间后，再恢复其血液供应的过程。多数研究表明，脑缺血再灌注后脑缺血性的损伤反而会加重。脑缺血再灌注后细胞坏死和细胞凋亡并存，缺血中心区主要是细胞坏死，是不可逆的；而细胞凋亡主要出现在缺血灶周围区即缺血半暗带，是可逆的，因此，脑缺血再灌注后神经细胞凋亡已成为研究的热点。

3.3 三个道地产区丹参活性成分的研究关于丹参药材的道地产区，郭宝林等考证[3]历史上河南、山东、湖北和山西等几个省都曾被视为丹参的道地产区。近代以来,川产丹参被视为佳品,其在《中国道地药材》中被列为道地药材。总结以上文献记载，丹参道地产区主要有四川、河南、山东、山西及湖北等5个产地。多数研究表明，不同产地丹参中丹参酮ⅡA、丹酚酸和丹参素等活性成分的含量差别较大。本研究所选用四川中江古店、山东沂南、河南方城三个道地产区丹参,经成都中医药大学严铸云教授等[4-5]测定丹参酮ⅡA、丹酚酸和丹参素等活性成分的含量差别较大，与多数文献报道结果相似。

3.4 三个道地产区丹参混合提取物对bcl-2、bax表达的影响 Bcl-2、bax是目前研究较多的一对凋亡调控基因。Bcl-2基因，即B细胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)，该基因最初在血淋巴细胞中被发现。近年来，多数研究也发现，bcl-2基因是抑制细胞凋亡的重要基因之一，它在脑缺血再灌注损伤中表达，而且起重要作用[6]。Bax是1993年在人前B细胞基因文库发现的一种基因，其作用与bc1-2相反，可抑制bcl-2的功能。以往的研究也显示[7-8]，局灶性脑缺血后，bax蛋白表达明显增加，其能与bcl-2蛋白形成异源二聚体，从而抑制bcl-2的功能，促进细胞凋亡。可见，Bcl-2和bax基因对脑细胞凋亡起重要作用，Bcl-2和bax表达水平的高低与细胞凋亡的严重性有直接关系。若bcl-2升高，则抑制细胞凋亡；而bax升高，则促进细胞凋亡。

河南、山东、四川三个道地产区丹参混合提取物均能明显提高bcl-2表达，降低bax表达，表明三产区丹参混合提取物通过上调bcl-2、下调bax的表达而抑制神经细胞凋亡，从而改善缺血再灌注损伤而发挥脑保护作用。同时发现，三个道地产区丹参混合提取物对bax和bcl-2表达的影响不同，对bax的表达，四川丹参组降低的幅度最大，山东丹参组次之，河南丹参组再次之；对bcl-2的表达，山东丹参组上调的幅度大于河南和四川丹参组，河南和四川丹参组无明显差异。

综上，三个道地产区丹参混合提取物均能影响bcl-2、bax的表达，抑制神经细胞凋亡，从而发挥脑保护作用；不同产区丹参混合提取物对各指标表达影响不同，其原因可能与不同产区丹参混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶点不一致有关。

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(收稿2016-06-18；修回2016-07-29)

*陕西省渭南职业技术学院课题(WZYY201322)

再灌注丹参(中药) 大鼠脑缺血细胞凋亡动物实验