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肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素肾病大鼠足细胞损伤的机制研究*

2016-12-15吴国庆窦一田曹式丽江西中医药大学附属医院南昌330006

陕西中医 2016年11期
关键词:细胞骨架裂孔肾小球

黄 勇 吴国庆 窦一田 曹式丽 江西中医药大学附属医院(南昌330006)



肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素肾病大鼠足细胞损伤的机制研究*

黄 勇 吴国庆 窦一田△曹式丽▲江西中医药大学附属医院(南昌330006)

目的:探讨中药复方肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素(PAN)肾病大鼠足细胞损伤的机制。方法:采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠足细胞损伤模型。将60只SD大鼠随机分为A组(对照组),B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组)、D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组),每组12只。治疗第1、2、3、4、6周末检测大鼠24h尿蛋白定量(24hUpro)及血清白蛋白(ALB)水平;第1、6周末分别处死6只大鼠留取肾脏组织,检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化;电镜观察肾小球足细胞超微结构的改变。结果:第6周末,C、D、E组24hUpro水平均低于B组,P<0.05;C、D、E组ALB水平均高于B组,P<0.05。第6周末,C、D、E组Nephrin、CD2AP表达均高于B组,P<0.05。C、D、E组大鼠肾小球基底膜增厚及足突融合程度较B组均明显减轻。结论:肾苏Ⅳ可降低PAN肾病大鼠24hUpro,提高ALB水平,促进足细胞骨架结构的损伤修复,阻抑足细胞损伤。

“风湿扰肾”,“肾络失和”常为慢性肾脏病病程中的重要病理因素。本课题在既往关于“肾络病证”研究的基础上,提出益气祛风、养血和络法干预慢性肾脏病足细胞损伤的创新性思路,通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠足细胞损伤模型进行干预。其旨在从创新发展的角度认识慢性肾脏病,进而提高中医药治疗疑难疾病的临床和研究水平。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 60只雄性SD大鼠,北京华阜康生物科技股份有限公司提供,体重160~180g,SPF/VAF级,许可证号SCXK(京)2014-0004。随机分为A组(对照组),B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组),D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组),每组12只。

1.2 PAN肾病大鼠模型制备 造模药物:嘌呤霉素(100mg/支,Lot. No. 419E042),北京索来宝生物科技有限公司提供。采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠模型,PAN剂量为10mg/100g体重。腹腔注射5%水合氯醛0.6ml/100g体重,取仰卧位固定,75%乙醇消毒、备皮,在颈部沿颈静脉方向切开2cm,分离皮下组织层,暴露颈静脉,经颈静脉注射PAN溶液,分层缝合切口。术后经腹腔给每只大鼠注射青霉素钾盐(10万U)溶液,连续3d。对照组颈静脉注射等剂量生理盐水。

1.3 治疗药物及给药方法 肾苏Ⅳ组成:生黄芪30g,青风藤、泽兰各15g,炒当归、汉防己、僵蚕、重楼各10g。上7味药共煎煮3次,浓缩成100ml汁液(1.00g生药/ml),无菌装瓶密封,置于4℃冰箱保存备用。给药方法:造模后第1天起,D组灌服肾苏Ⅳ剂量为1.80ml/200(g·d),C组为D组的1/2,E为D组的2倍,A、B组灌服生理盐水剂量为1.80ml/200(g·d),共灌服6周。

1.4 实验试剂与设备 实验试剂:24hUpro、ALB检测试剂盒由德赛诊断系统(上海)有限公司提供;Nephrin 、CD2AP购于英国Abcam公司;HRP标记山羊抗兔、HRP标记兔抗山羊、HRP标记兔抗小鼠、HRP标记兔抗大鼠购于美国KPL公司。实验仪器:日本日立H-7500型透射电镜;图像采集系统(GATANORIUS830)。

1.5 标本采集 治疗第1、2、3、4、6周末代谢笼收集大鼠24h尿液并测量尿量;目内眦取血,离心10min(3000rm/min),分离血清,-20℃保存待测。各组治疗第1、6周末分别处死6只大鼠,迅速打开腹腔,摘取肾脏,剥离肾包膜,4℃条件下,取部分肾脏皮质组织,制成1mm3组织块,置于4%戊二醛溶液固定,用于电镜检测。剩余肾组织迅速置于液氮中保存,后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.6 观察指标 24hUpro、ALB;Western Blotting法检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化;电镜观察肾小球足细胞形态改变。

1.7 统计学方法 实验结果应用SPSS16.0统计软件分析,各组实验数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 24h尿蛋白变化 第1周末,B、C、D、E组均明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);第3周始,C、D、E组均明显低于B组,差异有统计学意义(P<0.05);第6周末,D、E组均明显低于C组,差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.2 血清白蛋白变化 第1周末,B、C、D、E组均低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);第4周始,C、D、E组均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);第6周末,D、E组均明显高于C组,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

2.3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响 第1周末,B、C、D、E组均低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);第6周末:C、D、E组均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表3及图1。

2.4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响 第1周末:B、C、D、E组均低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);第6周末:C、D、E组均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);D、E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表4及图2。

表1 治疗第1、2、3、4、6周末24h尿蛋白定量变化(mg/24h)

表2 治疗第1、2、3、4、6周末血清白蛋白变化(g/L)

表3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响

表4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响

2.5 电镜观察肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞超微结构的影响 第6周末电镜检测结果,A组:肾小球足细胞足突排列均匀整齐;基底膜厚薄均匀一致;毛细血管内皮细胞正常;近曲小管结构亦正常。B组:肾小球足细胞足突明显增宽、融合成板片状,裂孔间隙消失;足突胞质肿胀;基底膜局部明显增厚;血管内皮细胞中度增生、融合,窗孔消失。C组:肾小球足突融合,裂孔间隙变窄;基底膜中度增厚;足突胞质轻度肿胀;血管内皮细胞中度增生。D组:肾小球基底膜轻度增厚;足突轻度融合;血管内皮细胞轻度增生。E组:肾小球基底膜轻度增厚;足突轻度融合;血管内皮细胞轻度增生,见图3。

注:A为对照组;B为模型组;C、D、E分别为中药低、中、高剂量组

3 讨 论 足细胞损伤是肾小球损伤的中心环节。MCD、FSGS、MN及DN的发生都与足细胞损伤密切相关[1]。当足细胞丢失10~20%时,肾小球损伤尚可修复;丢失20~40%时,将导致肾小球硬化;丢失超过50%时,肾小球滤过功能将严重受损,肾小球硬化而不可逆转[2]。故阻抑足细胞损伤是防治多种肾小球疾病的核心环节。肾脏病往往病程绵长,肾气虚弱是导致疾病慢性化的内在基础,湿浊、瘀血、热毒、外邪是疾病进程中虚实错杂的病理因素。其中“风湿扰肾”,“肾络失和”更是疾病复杂病理阶段的关键环节。我们前期围绕“肾小球固有细胞功能调节”、“肾脏血管损伤修复”等进行了大量的研究[3-4]。本研究系既往研究基础上,通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠进行干预,以探讨肾苏Ⅳ阻抑足细胞损伤的机制。方中以生黄芪、炒当归益气养血,充养肾络;以汉防己、青风藤、僵蚕祛风胜湿,搜剔肾络风湿伏邪;以重楼、泽兰解毒通络;诸药协同以益气祛风、养血和络,促进肾络气血调和。

PAN诱导的足细胞损伤主要表现为足突融合成板片状,裂孔间隙消失,继而足细胞表型发生改变,发展至肾小球硬化[5],是目前研究MCD和FSGS的理想动物模型。足细胞可通过构建肾小球滤过的分子和电荷屏障,分泌可溶性因子,协调裂孔隔膜内信号传递等作用维持肾小球滤过屏障功能的正常[6]。而这一切都要以完整的足细胞骨架结构为基础。Nephrin是位于肾小球裂孔隔膜的一种跨膜糖蛋白,属免疫球蛋白细胞黏附分子超家族[7]。电镜三维重构技术观察结果显示:相邻足突Nephrin分子胞外段通过嗜同性结合或嗜异性结合组成许多线形结构,构成足细胞裂孔隔膜[8]。Nephrin分子胞内段的酪氨酸残基磷酸化后可激活下游信号分子,形成足细胞内特有的信号转导通路,参与足细胞重要生理病理过程的调节[9]。Nephrin磷酸化程度的降低与蛋白尿的发生以及足细胞形态改变密切相关,进而导致肾小球通透性和足突形态发生改变,引发蛋白尿[10]。有研究提出Nephrin的检测可作为预测肾小球疾发展的指标[11]。CD2AP与Nephrin共同维护足细胞裂孔隔膜形态和功能的完整性[12]。CD2AP可结合黏附分子CD2,使CD2AP分子成簇,加强其在T细胞的抗原呈递细胞的接触面积,从而影响细胞骨架的极性[13]。研究发现FSGS及ESRD患者中存在CD2AP基因突变[14]。肾病综合征患者中CD2AP基因突变者表现为对激素依赖或激素抵抗[15]。CD2AP mRNA表达与24h蛋白尿定量、肾小球纤维化程度呈负相关,可作为评估肾小球病变程度及预后的重要指标[16]。

综上,如能有效调控Nephrin、CD2AP蛋白表达的平衡,或可阻抑足细胞病变的进展。本研究中,PAN诱导足细胞损伤第1周末,大鼠足细胞Nephrin、CD2AP表达均明显低于对照组,提示PAN肾病大鼠肾小球足细胞骨架结构受损。第6周末,肾苏Ⅳ治疗各组Nephrin、CD2AP表达均明显强于模型组,提示肾苏Ⅳ可有效修复PAN肾病大鼠足细胞骨架结构的损伤。结合实验中大鼠蛋白尿及足细胞超微结构的改变,可推测PAN肾病大鼠蛋白尿的出现与足细胞骨架结构的损伤密切相关,而通过促进足细胞骨架结构损伤的修复可有效降低尿蛋白的排泄,阻抑PAN肾病大鼠足细胞损伤。

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(收稿2016-07-18;修回2016-07-29)

*国家自然科学基金青年项目(81403333)

肾病/中医药疗法 嘌呤霉素 @复方肾苏Ⅳ 足细胞 大鼠 动物实验

R692

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.055

△天津中医药大学第一附属医院(天津300193)

▲通讯作者:天津中医药大学第一附属医院(天津300193)

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