肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素肾病大鼠足细胞损伤的机制研究*

黄 勇 吴国庆 窦一田 曹式丽 江西中医药大学附属医院(南昌330006)



肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素肾病大鼠足细胞损伤的机制研究*

黄 勇 吴国庆 窦一田△曹式丽▲江西中医药大学附属医院(南昌330006)

目的：探讨中药复方肾苏Ⅳ干预嘌呤霉素(PAN)肾病大鼠足细胞损伤的机制。方法：采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠足细胞损伤模型。将60只SD大鼠随机分为A组(对照组)，B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组)、D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组)，每组12只。治疗第1、2、3、4、6周末检测大鼠24h尿蛋白定量(24hUpro)及血清白蛋白(ALB)水平；第1、6周末分别处死6只大鼠留取肾脏组织，检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化；电镜观察肾小球足细胞超微结构的改变。结果：第6周末，C、D、E组24hUpro水平均低于B组，P<0.05；C、D、E组ALB水平均高于B组，P<0.05。第6周末，C、D、E组Nephrin、CD2AP表达均高于B组，P<0.05。C、D、E组大鼠肾小球基底膜增厚及足突融合程度较B组均明显减轻。结论：肾苏Ⅳ可降低PAN肾病大鼠24hUpro，提高ALB水平，促进足细胞骨架结构的损伤修复，阻抑足细胞损伤。

“风湿扰肾”，“肾络失和”常为慢性肾脏病病程中的重要病理因素。本课题在既往关于“肾络病证”研究的基础上，提出益气祛风、养血和络法干预慢性肾脏病足细胞损伤的创新性思路，通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠足细胞损伤模型进行干预。其旨在从创新发展的角度认识慢性肾脏病，进而提高中医药治疗疑难疾病的临床和研究水平。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 60只雄性SD大鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，体重160～180g，SPF/VAF级，许可证号SCXK(京)2014-0004。随机分为A组(对照组)，B组(模型组)、C组(肾苏Ⅳ低剂量组)，D组(肾苏Ⅳ中剂量组)及E组(肾苏Ⅳ高剂量组)，每组12只。

1.2 PAN肾病大鼠模型制备 造模药物：嘌呤霉素(100mg/支，Lot. No. 419E042)，北京索来宝生物科技有限公司提供。采用单次颈静脉注射法建立PAN肾病大鼠模型，PAN剂量为10mg/100g体重。腹腔注射5%水合氯醛0.6ml/100g体重，取仰卧位固定，75%乙醇消毒、备皮，在颈部沿颈静脉方向切开2cm，分离皮下组织层，暴露颈静脉，经颈静脉注射PAN溶液，分层缝合切口。术后经腹腔给每只大鼠注射青霉素钾盐(10万U)溶液，连续3d。对照组颈静脉注射等剂量生理盐水。

1.3 治疗药物及给药方法 肾苏Ⅳ组成：生黄芪30g，青风藤、泽兰各15g，炒当归、汉防己、僵蚕、重楼各10g。上7味药共煎煮3次，浓缩成100ml汁液(1.00g生药/ml)，无菌装瓶密封，置于4℃冰箱保存备用。给药方法：造模后第1天起，D组灌服肾苏Ⅳ剂量为1.80ml/200(g·d)，C组为D组的1/2，E为D组的2倍，A、B组灌服生理盐水剂量为1.80ml/200(g·d)，共灌服6周。

1.4 实验试剂与设备 实验试剂：24hUpro、ALB检测试剂盒由德赛诊断系统(上海)有限公司提供；Nephrin 、CD2AP购于英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔、HRP标记兔抗山羊、HRP标记兔抗小鼠、HRP标记兔抗大鼠购于美国KPL公司。实验仪器：日本日立H-7500型透射电镜；图像采集系统(GATANORIUS830)。

1.5 标本采集 治疗第1、2、3、4、6周末代谢笼收集大鼠24h尿液并测量尿量；目内眦取血，离心10min(3000rm/min)，分离血清，-20℃保存待测。各组治疗第1、6周末分别处死6只大鼠，迅速打开腹腔，摘取肾脏，剥离肾包膜，4℃条件下，取部分肾脏皮质组织，制成1mm3组织块，置于4%戊二醛溶液固定，用于电镜检测。剩余肾组织迅速置于液氮中保存，后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.6 观察指标 24hUpro、ALB；Western Blotting法检测肾小球足细胞Nephrin、CD2AP的表达变化；电镜观察肾小球足细胞形态改变。

1.7 统计学方法 实验结果应用SPSS16.0统计软件分析，各组实验数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 24h尿蛋白变化 第1周末，B、C、D、E组均明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第3周始，C、D、E组均明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末，D、E组均明显低于C组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.2 血清白蛋白变化 第1周末，B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第4周始，C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末，D、E组均明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

2.3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响 第1周末，B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末：C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表3及图1。

2.4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响 第1周末：B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；第6周末：C、D、E组均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；D、E组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4及图2。

表1 治疗第1、2、3、4、6周末24h尿蛋白定量变化(mg/24h)

表2 治疗第1、2、3、4、6周末血清白蛋白变化(g/L)

表3 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞Nephrin表达的影响

表4 肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞CD2AP表达的影响

2.5 电镜观察肾苏Ⅳ对PAN肾病大鼠足细胞超微结构的影响 第6周末电镜检测结果，A组：肾小球足细胞足突排列均匀整齐；基底膜厚薄均匀一致；毛细血管内皮细胞正常；近曲小管结构亦正常。B组：肾小球足细胞足突明显增宽、融合成板片状，裂孔间隙消失；足突胞质肿胀；基底膜局部明显增厚；血管内皮细胞中度增生、融合，窗孔消失。C组：肾小球足突融合，裂孔间隙变窄；基底膜中度增厚；足突胞质轻度肿胀；血管内皮细胞中度增生。D组：肾小球基底膜轻度增厚；足突轻度融合；血管内皮细胞轻度增生。E组：肾小球基底膜轻度增厚；足突轻度融合；血管内皮细胞轻度增生，见图3。

注：A为对照组；B为模型组；C、D、E分别为中药低、中、高剂量组

3 讨 论 足细胞损伤是肾小球损伤的中心环节。MCD、FSGS、MN及DN的发生都与足细胞损伤密切相关[1]。当足细胞丢失10～20%时，肾小球损伤尚可修复；丢失20～40%时，将导致肾小球硬化；丢失超过50%时，肾小球滤过功能将严重受损，肾小球硬化而不可逆转[2]。故阻抑足细胞损伤是防治多种肾小球疾病的核心环节。肾脏病往往病程绵长，肾气虚弱是导致疾病慢性化的内在基础，湿浊、瘀血、热毒、外邪是疾病进程中虚实错杂的病理因素。其中“风湿扰肾”，“肾络失和”更是疾病复杂病理阶段的关键环节。我们前期围绕“肾小球固有细胞功能调节”、“肾脏血管损伤修复”等进行了大量的研究[3-4]。本研究系既往研究基础上，通过筛选具有疗效优势的中药复方“肾苏Ⅳ”对PAN肾病大鼠进行干预，以探讨肾苏Ⅳ阻抑足细胞损伤的机制。方中以生黄芪、炒当归益气养血，充养肾络；以汉防己、青风藤、僵蚕祛风胜湿，搜剔肾络风湿伏邪；以重楼、泽兰解毒通络；诸药协同以益气祛风、养血和络，促进肾络气血调和。

PAN诱导的足细胞损伤主要表现为足突融合成板片状，裂孔间隙消失，继而足细胞表型发生改变，发展至肾小球硬化[5]，是目前研究MCD和FSGS的理想动物模型。足细胞可通过构建肾小球滤过的分子和电荷屏障，分泌可溶性因子，协调裂孔隔膜内信号传递等作用维持肾小球滤过屏障功能的正常[6]。而这一切都要以完整的足细胞骨架结构为基础。Nephrin是位于肾小球裂孔隔膜的一种跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白细胞黏附分子超家族[7]。电镜三维重构技术观察结果显示：相邻足突Nephrin分子胞外段通过嗜同性结合或嗜异性结合组成许多线形结构，构成足细胞裂孔隔膜[8]。Nephrin分子胞内段的酪氨酸残基磷酸化后可激活下游信号分子，形成足细胞内特有的信号转导通路，参与足细胞重要生理病理过程的调节[9]。Nephrin磷酸化程度的降低与蛋白尿的发生以及足细胞形态改变密切相关，进而导致肾小球通透性和足突形态发生改变，引发蛋白尿[10]。有研究提出Nephrin的检测可作为预测肾小球疾发展的指标[11]。CD2AP与Nephrin共同维护足细胞裂孔隔膜形态和功能的完整性[12]。CD2AP可结合黏附分子CD2，使CD2AP分子成簇，加强其在T细胞的抗原呈递细胞的接触面积，从而影响细胞骨架的极性[13]。研究发现FSGS及ESRD患者中存在CD2AP基因突变[14]。肾病综合征患者中CD2AP基因突变者表现为对激素依赖或激素抵抗[15]。CD2AP mRNA表达与24h蛋白尿定量、肾小球纤维化程度呈负相关，可作为评估肾小球病变程度及预后的重要指标[16]。

综上，如能有效调控Nephrin、CD2AP蛋白表达的平衡，或可阻抑足细胞病变的进展。本研究中，PAN诱导足细胞损伤第1周末，大鼠足细胞Nephrin、CD2AP表达均明显低于对照组，提示PAN肾病大鼠肾小球足细胞骨架结构受损。第6周末，肾苏Ⅳ治疗各组Nephrin、CD2AP表达均明显强于模型组，提示肾苏Ⅳ可有效修复PAN肾病大鼠足细胞骨架结构的损伤。结合实验中大鼠蛋白尿及足细胞超微结构的改变，可推测PAN肾病大鼠蛋白尿的出现与足细胞骨架结构的损伤密切相关，而通过促进足细胞骨架结构损伤的修复可有效降低尿蛋白的排泄，阻抑PAN肾病大鼠足细胞损伤。

[1] Hanamura K,Tojo A,Fujita T. Urinary and glomerular podocytes in patients with chronic kidney diseases[J]. Clin Exp Nephrol,2014,18(1): 95-103.

[2] Wharram BL,Goyal M,Wiggins JE,et al. Podocyte Depletion Causes Glomerulosclerosis: Diphtheria Toxin-Induced Podocyte Depletion in Rats Expressing Human Diphtheria Toxin Receptor Transgene [J]. Journal of the American Society of Nephrology,2005,16(10): 2941-2952.

[3] 窦一田,任 桐,曹式丽.辛通畅络法干预局灶节段性肾小球硬化大鼠细胞外基质积聚的实验研究[J].时珍国医国药,2011,22(9):2070-2072.

[4] 窦一田,高先楼,曹式丽.肾苏Ⅱ对系膜增生性肾炎模型大鼠肾病变及白细胞介素-6的影响[J].中医杂志,2011,52(13):1131-1134.

[5] Zennaro C,Rastaldi M P,Pascolo L. Podocyte expression of membrane transporters involved in puromycin aminonucleoside-mediated injury [J]. PLoS One,2013,8(6): e66159.

[6] Tharaux PL,Huber TB. How many ways can a podocyte die[J]. Semin Nephrol,2012,32(4): 394-404.

[7] Ristola M,Lehtonen S. Functions of the podocyte proteins nephrin and Neph3 and the transcriptional regulation of their genes [J]. Clin Sci (Lond),2014,126(5): 315-328.

[8] Wartiovaara J,Ofverstedt LG,Khoshnoodi J,et al. Nephrin strands contribute to a porous slit diaphragm scaffold as revealed by electron tomography [J]. J Clin Invest,2004,114: 1475-1483.

[9] Drozdova T,Papillon J,Cybulsky AV. Nephrin missense mutations: induction of endoplasmic reticulum stress and cell surface rescue by reduction in chaperone interactions [J]. Physiological Reports,2013,1(4): e00086.

[10] Arias LF,Vieco BE,Arteta AA. Expression of nephrin,podocin and a-actinine-4 in renal tissue of patients with proteinuria [J]. Nefrologia,2009,29(6): 569-575.

[11] Ichimura K,Fukuyo Y,Nakamura T,et al. Developmental localization of nephrin in zebrafish and medaka pronephric glomerulus [J]. J Histochem Cytochem,2013,61(4): 313-324.

[12] Asanuma K,Campbell KN,Kim K,et al. Nuclear relocation of the nephrin and CD2AP- binding protein dendrin promotes apoptosis of podocytes [J]. Proc Natl Acad Sci USA.,2007,104(24): 10134-10139.

[13] Lu C,Ren W,Su XM,et al. CREB and Sp1 regulate the human CD2AP gene promoter activity in renal tubular epithelial cells[J]. Arch Biochem Biophys,2008,474(1): 143-149.

[14] Hyvonen M E,Ihalmo P,Sandholm N,et al. CD2AP is associated with end-stage renal disease in patients with type 1 diabetes [J]. Acta Diabetol,2013,50(6): 887-897.

[15] Gigante M,Pontrelli P,Montemurno E,et al. CD 2AP mutations are associated with sporadic nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) [J]. Nephrology Dialysis Transplantation,2009,24(6): 1858-1864.

[16] Lv L L,Cao Y H,Pan M M,et al. CD2AP mRNA in urinary exosome as biomarker of kidney disease [J]. Clin Chim Acta,2014,428: 26-31.

(收稿2016-07-18；修回2016-07-29)

*国家自然科学基金青年项目(81403333)

肾病/中医药疗法 嘌呤霉素 @复方肾苏Ⅳ 足细胞 大鼠 动物实验

R692

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.055

△天津中医药大学第一附属医院(天津300193)

▲通讯作者：天津中医药大学第一附属医院(天津300193)