大豆DNA导入春小麦后的农艺性状和品质性状分析及RAPD标记验证

贾影影，刘凤楼，王掌军，刘生祥，陈丽萍，郭丽静

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)



大豆DNA导入春小麦后的农艺性状和品质性状分析及RAPD标记验证

贾影影，刘凤楼，王掌军，刘生祥，陈丽萍，郭丽静

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

为探讨大豆DNA导入对春小麦农艺和品质性状的影响，在2012-2014年间，对宁春4号、宁春44号、高代品系J058号及其通过花粉管通道法分别导入大豆品种铁丰31号、承豆6号、汾豆78号和铁9808号基因组DNA的后代株系进行了籽粒蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值及株高、穗长、穗粒数、穗粒重和千粒重等农艺性状分析，并利用RAPD标记对导入系进行了验证。结果表明，大豆基因组DNA导入系的农艺性状和品质性状与导入受体相比发生了明显的变化。以宁春4号为受体、铁9808号为供体的导入系019的经济系数和千粒重分别高出亲本14.33%和14.84%，且与受体差异显著。以宁春4号为受体、承豆6号为供体的导入系013在2012年所有导入系中蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值均最大，两年试验的多重比较结果中仅导入系013的蛋白质含量与亲本宁春4号间差异显著，且较亲本高出13.33%。18个RAPD引物中有3个引物扩增出清晰带型，在受体小麦和供体大豆亲本间存在多态性，且部分导入系出现供体条带，如导入系013、015、019和020。试验最终获得了农艺性状优良、蛋白质含量增高的导入系013作为后续研究的重点。

春小麦；大豆；花粉管通道法；农艺性状；品质分析；RAPD标记

小麦是世界上重要的粮食作物之一，同时也是我国重要的商品粮和储备粮。目前，我国大面积种植的小麦品种的面粉加工品质偏低，多数品种均达不到国外优质小麦分级标准[1]。因此，通过引入外源基因创制小麦品质育种中可利用的种质或中间材料是提升小麦品质的有效途径之一。

大量研究和实践表明[2-7]，通过花粉管通道法可以成功的将外源物种的DNA导入小麦中，并获得理想的变异材料，实现了对受体植株的遗传改良，获得了新种质或新品系、品种。张 立等[8]利用花粉管通道法将豌豆DNA导入小麦并对其后代进行分子验证，结果证明利用花粉管通道法提高小麦蛋白质含量是可行的。王秀玲等[9]将野生大豆总DNA导入小麦中，获得了转基因小麦品系。刘 萍等[10]将燕麦总DNA导入普通小麦宁春4号中，获得了12个稳定的变异品系，并对稳定变异的品系进行了RAPD标记验证，从分子水平上证明了燕麦DNA可以通过花粉管通道进入受体小麦，并与受体基因组DNA整合，在后代中遗传和表达。欧巧明等[6]利用花粉管通道法导入高粱DNA创造了2个均含有7+8、5+10优质亚基的稳定优良小麦变异新品系，其HMW-GS发生明显变异，与受体小麦相比，变异新品系的品质指标得到了提升。

目前，虽然大豆DNA导入小麦已有研究，但对大豆DNA导入春小麦并对导入材料进行多年对比分析的探索鲜有报道。鉴于此，本研究在2012-2014年间，对宁春4号、宁春44号、高代品系J058号及其通过花粉管通道法分别在以上3份材料中导入大豆品种铁丰31号、承豆6号、汾豆78号和铁9808号基因组DNA的后代株系进行籽粒蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值等品质性状及株高、穗长、穗粒数、穗粒重和千粒重等农艺性状分析，并利用RAPD标记对品质及农艺性状表现较好的导入系进行验证，以期获得表现优良的导入后代株系，为小麦高产及品质育种研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及其种植

供试材料包括普通小麦品种宁春4号、宁春44号、高代品系J058号以及分别以宁春4号、宁春44号、J058号为受体通过花粉管通道法导入大豆品种铁丰31号、承豆6号、汾豆78号和铁9808号基因组总DNA的35个后代株系(经过5年连续选择，性状已基本稳定)(表1)，均由宁夏大学农学院作物遗传育种实验室小麦育种组提供。

表1 大豆DNA导入春小麦的35个株系

所有供试材料于2012-2014年3月4日至3月7日种植于宁夏中部黄河冲积平原永宁县内的宁夏大学实验农场内，全生育期灌水3次。试验采用随机区组设计，6行区，行长1.20 m，行间距0.15 m，区间距0.30 m，人工开沟撒播。按照大田常规栽培管理措施进行管理。

1.2 农艺性状的测定

随机选取2013年和2014年种植的长势一致的供试材料各15株，在成熟期收获并晾晒风干后进行室内考种，分别测定各单株的株高、穗长、穗下茎节长、穗粒数、穗粒重、千粒重、经济产量(植株脱粒后的籽粒重量)和生物产量(收获后未脱粒前的植株重量)，取平均值。同时，计算经济系数。经济系数=经济产量/生物产量。

1.3 品质性状的测定

随机称取从2012年和2013年收获的各受体亲本及农艺性状表现较好的12个导入系(007、013、015、019、020、024、025、028、033、035、037和045)的种子样品各3份，利用瑞典波通9200整粒谷物近红外分析仪(宁夏农林科学院农作物研究所)测定蛋白质含量、湿面筋含量及沉降值，取平均值。

1.4 RAPD标记分析

RAPD标记分析所用材料同1.3。18条随机引物(表2)均由上海生工生物工程公司合成。采用SDS法提取3个受体小麦、4个供体大豆及相应导入系材料叶片的全基因组DNA。RAPD扩增体系(10 μL)：10× PCR缓冲液1.0 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) 0.6 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.4 μL，引物(30 ng·μL-1)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，ddH2O 3.9 μL，模板DNA(15 ng·μL-1)2.0 μL。按照以上扩增体系将PCR反应液配制好后混匀，用10 μL的石蜡油覆盖，在PCR仪中进行扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，37～55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s，45个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。反应结束后，每个体系中加1.5 μL的溴酚蓝混匀，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的多态性，试验重复3次。

1.5 数据分析

试验数据采用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 亲本及其导入系的农艺性状

对亲本及导入系材料连续两年(2013、2014)农艺性状调查结果(表3)分析表明，宁春4号导入系除穗长和穗下茎节长外其他农艺性状的最大值均显著高于亲本，其中，导入系015的株高高出亲本2.72%，导入系013的穗粒数多出亲本11.21%，导入系019的穗粒重、经济系数和千粒重分别较亲本高出14.43%、14.33%和14.84%。且宁春4号的导入系穗粒重的变异系数最大，为21.45%；穗下茎节长的变异系数最小，为6.48%；其他性状的变异系数均在6.48%～14.22%之间。J058号的导入系除穗下茎节长外其他农艺性状的最大值均显著高于亲本，其中导入系020的株高和穗粒数分别较亲本高4.91%和23.11%，导入系028的经济系数和千粒重分别较亲本高7.72%和8.44%。J058号导入系穗粒重的变异系数最大，为23.56%；穗下茎节长的变异系数最小，为7.22%；其他性状的变异系数均在7.25%～17.93%之间。宁春44号导入系除千粒重外其他农艺性状的最大值均显著高于亲本，且穗长、穗下茎节长的最小值也显著高于亲本，其中，导入系033的株高和千粒重分别比亲本高6.91%和1.03%，导入系035的穗长、穗下茎节长和穗粒数较亲本分别高12.51%、4.22%和10.54%，导入系045的穗粒重和经济系数分别较亲本高7.31%和7.11%。宁春44号导入系穗粒重的变异系数最大，为20.88%；千粒重的变异系数最小，为5.30%；其他性状的变异系数均在5.52%～16.79%之间。结果表明，导入系019、028和045的产量性状均比较突出，但导入系019有利变异更为明显。

表2 18条随机引物序列信息

表3 亲本及其导入系的农艺性状比较

数字后不同字母表示亲本及相对应的导入系间差异在0.05水平上显著；试验中各个亲本及相对应的导入系均参与了多重比较，但表中仅列出了亲本及相对应的导入系中最大值和最小值的多重比较结果。

The different letters following data indicate significant difference between the parents and corresponding introgression lines at 0.05 level; Multiple comparisons were done between the parents and corresponding introgression lines,but only the data for parents,the maximum and minimum value of the lines are shown in the table.

2.2 亲本及其导入系的品质性状

亲本及导入系材料连续两年(2012、2013)的品质性状分析结果显示，各导入系的品质性状也发生了改变。以宁春4号为受体的材料中，导入系013、015蛋白质含量、湿面筋含量及沉降值均高于亲本(图1A、图1B、图1C)，其中品质性状表现比较突出的导入系013的各品质指标在2012年比亲本均高出20%。由于2012年材料中亲本J058号数据的缺失，仅分析了2013年J058号及其导入系的品质数据。导入材料中湿面筋含量均高于亲本(图1B)，蛋白质含量和沉降值除导入系020外也均高于亲本(图1A、图1C)，其中品质性状较为突出的导入系028的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值分别比亲本高出 7.54%、26.81%和17.91%。以宁春44号为受体的材料中，导入系的沉降值均高于亲本(图1C)，蛋白质含量和湿面筋含量除了导入系035外均高于亲本(图1A、图1B)，其中性状表现突出的导入系033蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值在2012年分别较亲本高出3.01%、13.11%和23.61%。

在2012和2013年，导入系013蛋白质含量均最高，且与亲本宁春4号差异显著，较亲本平均高出13.33%(图1D)；导入系025和013湿面筋含量比其他材料高，且与亲本J058号和宁春4号差异显著，分别较亲本高出27.13%和16.44%(图1E)；各导入系的沉降值与对应亲本间差异均不显著(图1F)。综合来看，导入系013的品质性状最佳。

A：2012和2013年亲本及其导入系蛋白质含量的变化；B：2012和2013年亲本及其导入系湿面筋含量的变化；C：2012和2013年亲本及其导入系沉降值的变化；D：亲本及其导入系蛋白质含量的比较；E：亲本及其导入系湿面筋含量的比较；F：亲本及其导入系沉降值的比较；1：宁春4号；2：007；3：013；4：015；5：019；6：J058号；7：020；8：024；9：025；10：028；11：宁春44号；12：033；13：035；14：037；15：045；2012年007与J058号数据缺失；字母表示亲本及相对应的导入系间差异在0.05水平上显著。

A: Variation of protein content of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; B: Variation of wet gluten content of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; C: Variation of sedimentation value of parents and their introgression lines in 2012 and 2013; D: Comparison on protein content of parents and their introgression lines; E: Comparison on wet gluten content of parents and their introgression lines; F: Comparison on sedimentation value of parents and their introgression lines; 1: Ningchun 4; 2: 007; 3: 013; 4: 015; 5: 019; 6: J058; 7: 020; 8: 024; 9: 025; 10: 028; 11: Ningchun 44; 12: 033; 13: 035; 14: 037; 15: 045; Data of 007 and J058 was missing in 2012; The different letters indicate significant difference between the parents and corresponding introgression lines at 0.05 level.

图1 2012和2013年亲本及其导入系的品质性状分析

Fig.1 Quality analysis of parents and their introgression lines in 2012 and 2013

2.3 RAPD标记分析结果

18条引物对所有供体、受体及12个导入系材料的全基因组DNA进行了RAPD扩增分析，结果显示，仅有其中3条引物(S64、S103和S437)对19个样品的DNA扩增产物带型出现明显差异(图2)，占全部所用引物的16.70%。

扩增结果中，小麦与大豆的目的条带均在500～2 000 bp之间，且每条引物的带型结果中均表现为3个小麦亲本的主带大小相同或相似，四个大豆供体的主带大小相同或相似，同时小麦受体与大豆供体扩增条带间均存在明显差异，3条引物的重复试验也显示出相同的结果。其中，引物S64在受体亲本和导入供体中均扩增出3条条带，在导入系013中，与亲本宁春4号有明显差异，新增了1条条带，且与供体大豆DNA条带明显不同；导入系045中，只扩增出2条条带，与亲本J058号相比出现条带消失的现象，其余导入系的条带均与对应亲本一致(图2A)。引物S103是3个引物中表现较好的，能区别三个小麦亲本及导入供体，导入系013与亲本宁春4号相比出现了条带的增加，但导入系015与小麦亲本相比又出现了条带的消失，且均出现了供体条带，导入系019、020、024、025和028也均出现供体条带，尤其是导入系036和037与亲本J058号及导入供体有明显差异，与亲本相比均出现条带的消失(图2B)。引物S437在受体小麦与导入供体中扩增结果差异明显，且部分导入系与对应亲本存在条带的增加和消失，但大部分导入系的条带均与受体小麦相一致(图2C)。说明大豆DNA导入春小麦后导入系发生了不同程度的变异。

A～C分别代表引物S64、S103和S437的扩增结果；M：2000 bp DNA ladder；1：宁春4号；2：宁春44号；3：J058号；4：铁丰31号；5：承豆6号；6：汾豆78；7：铁9808；8：007；9：013；10：015；11：019；12：020；13：024；14：025；15：028；16：033；17：036；18：037；19：045。

A-C indicate amplication results with primer S64,S103 and S437,respectively; M: 2000 bp DNA ladder ; 1: Ningchun 4; 2: Ningchun 44; 3: J058; 4: Tiefeng 31; 5: Chengdou 6; 6: Fendou 78; 7: Tie 9808; 8: 007; 9: 013; 10: 015; 11: 019; 12: 020; 13: 024; 14: 025; 15: 028; 16: 033; 17: 036; 18: 037; 19: 045.

图2 3条RAPD引物对大豆、小麦及其导入系的扩增结果

Fig.2 Amplication results for soybeans,common wheats and their introgression lines with RAPD markers

3 讨 论

利用花粉管通道法转移外源DNA已被广泛应用于小麦[8,12-13]、棉花[14-15]和玉米[16-17]等作物。当外源DNA导入小麦后，其导入材料的农艺性状和品质性状都是衡量变异的重要指标。由于豆类作物含有丰富的优质蛋白，因此，前人在豆类DNA通过花粉管通道法导入普通小麦的实践中已经积累了一定的经验[8-9]。本研究通过花粉管通道法将大豆基因组DNA导入春小麦中，对小麦亲本及其导入系农艺性状和品质性状的多年对比研究表明，尽管导入系的农艺性状和品质性状发生了部分明显的变异,但大部分性状都与受体小麦保持一致，这与以往的研究结果类似[12,18-19]。外源基因导入具有双重作用：一是基因转移作用；二是诱变作用[20]。在本研究中，导入系穗长、穗粒数、穗粒重、经济系数变化最明显，另外株高、穗下茎节长、千粒重等农艺性状也有明显变异。其中，以宁春4号为受体、铁9808为供体的导入系019，在连续两年的田间试验中除穗长外其余性状均表现出与亲本宁春4号有差异显著的变异。除此以外，不同小麦亲本中均出现了穗粒数、穗粒重、经济系数和千粒重较亲本有所提高的导入系，如以宁春4号为亲本的导入系013和015；以J058号为亲本的020和028，以宁春44为亲本的导入系033、035和045。

因大豆含有几乎全面的营养成分，从而被誉为高效的“生物工厂”[9]，因此本研究选用大豆作为提高小麦品质的基因源。试验中部分导入系连续两年的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值均高于受体亲本，如导入系013、015、033和037。其他导入系如020和024在两年试验中品质性状均保持上升的趋势，导入系033、037和045品质性状两年试验的结果均高于宁春44号，数据年际变化小。但两年试验的多重比较结果中仅有导入系013的蛋白质含量与亲本宁春4号间差异显著，同时其湿面筋含量与宁春4号差异也显著。除导入系025的湿面筋含量与亲本J058号差异显著外，其他导入系各品质性状与亲本间的差异均未达到显著水平。试验结果从侧面反映了品质性状数据年际间变化规律相对一致，但农艺性状因受环境影响，变化较大。

花粉管通道法导入外源DNA可以通过RAPD分析来验证[9-10]。本研究所用的RAPD标记均为前人利用豆类DNA对小麦进行遗传转化而设计的，因此，18个引物中有3个引物可以清晰的区分供体大豆和受体小麦亲本。但由于大豆和小麦亲缘关系较远，外源基因整合检测要比亲缘关系较近的燕麦和高粱等困难。前人研究中，导入外源DNA后经过RAPD分析得出，导入系既存在条带的增加和消失，也同样会出现供体条带[9,21]。在本研究中，引物S64在导入系013处新增了1条条带，引物S103在导入系013、015、019、020、024、025和028均出现了供体条带，说明供体的某些DNA片段可能进入了受体基因组中。导入系013蛋白质含量明显提高且与亲本宁春4号差异显著，两年平均值较亲本高出13.3%。表明导入后代中品质性状发生了变异并能稳定遗传。但这种蛋白质含量增高的变异是否因接受了外源大豆DNA片段，还需要进一步的深入分析。

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Study on Agronomic and Quality Traits and RAPD Marker Analysis of Transgenic Spring Wheat with Soybean DNA

JIA Yingying,LIU Fenglou,WANG Zhangjun,LIU Shengxiang,CHEN Liping,GUO Lijing

(School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan,Ningxia 750021,China)

For a better understanding of common wheat quality breeding,three spring wheat varieties/lines,Ningchun 4,Ningchun 44,and J058,and their introgression lines created by pollen-tube pathway using genomic DNA of soybean varieties Tiefeng 31,Chengdou 6,Fendou 78 and Tie 9808,respectively,were used.Quality traits,such as protein content,wet gluten content and sedimentation were analyzed and plant height,spike length,thousand-kernel weight,grains per spike and other agronomic traits were also investigated after harvest at the mature period during 2012-2014.Besides,RAPD marker analysis was conducted.The results showed that related agronomic traits and quality traits of introgression lines had changed in comparison with parents.The economic coefficient and the thousand-kernel weight of introgression line 019 were significantly higher than those of the parent Ningchun 4 with an increase rate of 14.33% and 14.84%,respectively.In 2012,quality traits of introgression line 013 were reached highest level in all tested lines.Multiple comparison results revealed that only the protein content of introgression line 013 reached significant level,with the increase rate of 13.33%,compared to the parent Ningchun 4.Eighteen random primers were employed to amplify genomic DNA of the donor soybeans and the receptor wheat materials as well as their introgression lines.Of them,three RAPD markers gave clear bands to separate the soybeans from wheat evidently.Polymorphic bands were detected between wheat parents and soybeans as well as part of introgression lines which had donor bands,such as introgression lines 013,015,019 and 020.The introgression line 013 which had remarkable agronomic traits and improved protein content was finally selected as a new material for future study.

Spring wheat; Soybean; Pollen tube pathway; Agronomic traits; Quality analysis; RAPD marker

时间：2016-07-07

2016-02-22

2016-05-23

宁夏回族自治区农业育种专项(2013NYYZ-02)；国家自然科学基金项目(31301305)

E-mail：jiayingying123@126.com

刘凤楼(E-mail:liufenglou@nxchampion.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0833-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1529.004.html