美国FDA对登革病毒核酸扩增检测试剂性能研究要点

吴传松 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心 （北京 100044）

美国FDA对登革病毒核酸扩增检测试剂性能研究要点

吴传松 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心 （北京 100044）

登革病毒引起黄热病以及登革感染流行在我国均有报告，登革病毒核酸扩增检测试剂作为登革病毒的重要检测手段之一，其试剂检测性能研制显得非常重要。本文介绍了美国FDA对登革病毒核酸扩增检测试剂性能的相关要求，以期对我国从事登革病毒核酸扩增检测试剂的研究人员提供一些技术思路。

登革病毒 性能研究

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，登革病毒基因组为单股正链RNA，长约11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。登革病毒分为4个血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）。登革病毒核酸扩增检测试剂是指运用RT-PCR原理检测人血清或血浆中血清型1型、2型、3型或4型登革病毒RNA[1]。该类试剂通常包括探针、引物、酶及质控等，用于扩增和检测血清型1型、2型、3型或4型血清和血浆中登革病毒RNA。登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。登革热主要流行于世界热带和亚热带地区，东南亚、西太平洋地区和美洲，多呈地方性流行。我国主要流行于广东、海南、广西、福建、云南、台湾等地，夏、秋季是主要传播季节。2013年，全国报告病例4663例[2]，波及26个省、市、自治区。

1.登革病毒检测试剂监管要求概述

美国FDA对登革病毒核酸扩增检测试剂按照II类特殊管理。一方面，II类特殊管理需满足上市前监督研究，跟踪随访使用产品的患者情况，满足《登革病毒核酸检测试剂指导原则》[3]关于该类试剂安全性及有效性具体要求和产品性能标准特殊标识要求。另一方面，该产品还需要符合《美国食品药品及化妆品法》[4]其他要求或符合由其他联邦政府机构管理的联邦法和规则要求。

世界卫生组织（WHO）于2009年发布《登革热诊断、治疗、预防和控制指南》[5]，2012年发布《登革热预防与控制全球策略》[6]；我国依据《中华人民共和国传染病防治法》[7]，对登革病毒按照国家法定传染病乙类传染病管理。依据《体外诊断试剂注册管理办法》[8]，登革病毒核酸检测试剂属于病原体类检测，按照体外诊断试剂三类管理。我国也出台了《登革热诊疗指南（2014年版）》[9]、《登革热诊断标准WS 216-2008》[10]、《广东省重症登革热诊疗指引（2014年版）》[11]等技术文件。

2.产品性能评价要求

该部分内容不仅有助于审评机构在审评期间了解产品的性能特性，也可以帮助用户更好地理解产品的特点。研究人员提供产品分析性能研究清单需包括该产品所有性能研究特性的详细描述信息，同时需提供研发试剂盒时的评价方案、评价指标以及数据汇总信息等。

2.1 分析灵敏度（最低检测限）

对于登革病毒核酸扩增检测试剂而言，最低检出限是该类试剂盒能否及时准确地发现病原体存在的重要依据之一。该研究必须包括登革病毒血清型-1型、2型、3型、4型样本检测，这些样本来源建议采用病毒培养并以（pfu/ml）为单位表示病毒滴度。不同血清型系列稀释样本，每个稀释病毒滴度水平重复检测3至5次。为去除基质效应，稀释样本溶液应采用登革病毒检测阴性人血清或血浆或相似基质溶液。采用95%置信区间阳性检出率作为最低检测限确定标准。在拟确定最低检测限水平附近额外检测至少20份平行样本，以证明病毒检出率在95%可信区间。最低检出限单位可采用RNA病毒拷贝数或pfu/ml。需在该试剂配套常见适用机型上验证不同类型样本最低检测限。在满足上述要求的同时，通过额外检测4种登革病毒血清型其他菌株，包括不同登革病毒流行病毒株，进一步验证试剂最低检出限。研究人员可以通过文献或其他方法排除研究中未验证的登革病毒株，但需在产品说明书中明确未验证的不同登革病毒株。

表1. 推荐检测病原体

2.2 分析特异性

2.2.1 交叉反应

用于登革病毒核酸扩增检测试剂交叉反应验证的病原体种类，主要考虑与登革病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的其他黄热病属病毒（如圣路易斯脑炎、西尼罗病毒、黄热病、日本脑炎），甲病毒属病毒（如东部马脑炎），其他病毒和细菌引起的发烧和皮疹症状（如肠道病毒、单纯疱疹）。需检测表1中列出的具有潜在交叉反应的病毒体，这些病原体可能引起发热性疾病。病原体需有临床意义的相关浓度检测，细菌浓度水平建议至少106cfu/ml，病毒浓度水平能造成的假阴性结果进行质控。研究人员应对内标的引物、探针和模板浓度进行验证，应降低对靶基因检测造成竞争性抑制而产生的假阳性；另一方面，应保证内标荧光通道呈明显阳性曲线。内标材料可以是与登革病毒共同提取的人类核酸片段，如管家基因。建议至少105cfu/ml。需明确进行交叉反应病毒或细菌类型及滴度。

2.2.2 干扰物研究

评价干扰物质对该类试剂性能影响时，建议在病毒检测临界值水平对每种干扰物质干扰影响进行检测。干扰物浓度分布应覆盖人体生理及病理状态下可能出现的物质浓度。应注明不同干扰物质对被检测物质无干扰最高限值。其他潜在干扰物包括但不限于表2中物质。

2.3 精密度

研究人员应对每项精密度指标评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数范围等。本类试剂精密度评价主要包括以下要求：应包含影响检测精密度相关变量，除试剂（包括核酸分离/纯

化组分）本身影响外，还应对操作者、配套仪器、不同实验环境等要素进行相关验证。设置合理精密度评价周期，例如：为期至少12天检测，每天至少由两人完成不少于两次完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间精密度进行综合评价。研究人员应选择不同实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。用于精密度评价的参考品应包括阴性参考品、弱阳性参考品和高浓度参考品等。

2.4 质控品设置要求

2.4.1 阴性质控品

设置阴性质控品用于评价非特异扩增或检测过程，应保证不存在登革病毒序列，不会得到相关信号。建议采用无登革病毒序列的患者样本，阴性样本包括非靶序列核酸片段。如果用于评估核酸提取过程，建议包含登革病毒全基因片段。

2.4.2 阳性质控品

设置阳性质控品主要用于质控整个核酸检测过程，包括RNA提取、扩增和检测。阳性样本设置应模仿病人临床真实样本。阳性质控物包括靶序列核酸，阳性质控品材料来源可以是临床样本提取的登革病毒或者登革病毒株。

2.4.3 内标（内对照）

设置内标（内对照）主要用于对管内抑制可

表2. 潜在干扰物研究

2.5 核酸提取

对核酸扩增检测试剂而言，核酸提取方法是影响检测结果的关键因素之一。不同提取方法可能会产生不同登革病毒核酸质量和数量。从人血清或血浆样本中纯化登革病毒可能面临着低浓度病毒拷贝情况，存在高浓度人源性基因型DNA、高浓度蛋白或其他背景材料。

基于以上原因，为得到满足试剂检测的登革病毒RNA的数量和质量，研究人员必须结合试剂评估核酸提取方法效率，应用试剂评价整个核酸检测过程（包括核酸提取过程），用最低检出限和重复性评价提取方法的合理性。

2.6 样本收集和处理

核酸靶序列质量和数量与样本来源，样本采集方法，样本处理方法（运输条件、存储时间、温度）密切相关。研究人员应在产品说明书推荐样本收集与处理方法下完成产品分析性能评估。例如：推荐储存时间和温度（包括冻存次数）对样本稳定性研究。需说明关于所有不同类型样本收集和处理方法以及样本稳定的储存条件。

根据登革病毒对人体侵染特性结合临床表征，一方面，需明确该类产品适用样本类型以及收集样本合适时间或窗口时间；另一方面，应明确样本排除标准和接受标准。例如：研究人员应推荐可接受的样本存储条件、冻融次数、运输条件等。对于登革病毒检测而言，应注明样本必须在登革病症状发作后尽快收集且注意生物安全风险防范。

2.7 cut-off值研究

研究人员应说明cut-off值被确定的依据，提供cut-off值研究方案、研究过程以及研究原始数据等。例如：人群流行学信息、结果分布、95%结果区间和99%结果区间、非阴性（阳性，灰区）结果等。应列举cut-off值计算过程中采用的所有统计学方法。如果试剂存在灰区，应解释说明如何确定灰区范围。最后，用试剂在独立样本人群中对研究确定的cut-off值进行验证。

2.8 检验结果解释

检测结果解释部分必须列出所有可能的检测结果，说明如何确定登革病毒RNA的存在与不存在，阳性/阴性质控品所有可能的结果。必须对可接受和不可接受的质控结果进行解释。如检测试剂存在灰区范围，应给出检测结果为灰区的解释以及如何对灰区结果进行下一步处理措施。如检测结果需要重复检测灰区或不可靠结果，应说明重复检测的接受标准。如同一病人重复检测出现相同或不同结果，当检测结果为无效时，应定义无效结果判定标准。研究人员需推荐无效结果处理意见，如建议复检，则必须提供类似于对模棱两可结果重新检测的措施，重新测试是否来自相同核酸试剂，是否采用新的提取方法，是否检测患者留存样本或重新采集患者样本等。根据产品检测原理、适用人群、临床预期用途，在分析检测结果时，应考虑减少检测试剂假阴性和假阳性的可能性。检测试剂阴性结果不能排除登革病毒感染，也不能作为患者治疗的唯一依据。检测结果为阴性时，应增加确诊发热疾病后3至6天的样本，使用登革病毒IgM检测试剂进行复测，增加登革病毒诊断结果的可靠性。假阴性结果可能因为样本不恰当采集、运输及处理、样本中存在扩增抑制剂或者样本中病原体数量不足。登革病毒RNA检测仅能说明患者中存在登革病毒，但不能说明登革病毒侵染程度，也不能说明登革病毒是患者临床症状的主要致病媒介，检测结果也不能排除疾病是由其他细菌或病原体引起，试剂结果解释应结合其他实验室检测结果以及该患者临床病症进行综合分析。对于免疫抑制或免疫缺陷患者检测结果解释必须谨慎，该检测试剂尚不适用对新生儿脐带血、育龄人群产前筛查、无登革热病症的一般人群筛查等用途。也不适用于血源筛查或血浆捐献者筛查。该试剂检测过程中应注意生物安全防护和避免生物污染，相关检测人员应具有病原学检测经验，并接受标准化分子检测培训。

3.结语

登革病毒属于我国乙类传染性病毒，登革病毒核酸扩增检测试剂检测结果将直接反映患者体内是否存在登革病毒感染，对个体治疗方案制定以及对登革热疫情预防和监测产生影响。登革病毒核酸扩增检测试剂检测过程中应尽可能避免假阴性和假阳性。性能研究方案应结合产品预期用途、反应原理、样本类型等综合因素设计。在研究中应将性能研究作为研制试剂的重要环节，并在临床使用过程中不断改进试剂质量。

[1] 张富春.登革热的诊断与治疗[M].北京：人民卫生出版社，2014：5-16.

[2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.2013年度全国法定传染病疫情情况[EB/OL]. (2014-02-13)[ 2016-5-23].http://www.nhfpc.gov.cn/jkj/s3578/201402/26700e8a83c04205913a106545069a11.shtml

[3] FDA.Class II Special Controls Guideline: Dengue Virus Nucleic Acid Amplification Test Reagents [EB/OL].(2014-05-30) [2016-5-23].http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ucm399136.htm[4] The United States Congress.(2013-08-24)[2016-5-23]. FEDERAL FOOD, DRUG, AND COSMETIC ACT http:// legcounsel.house.gov/Comps/FDA_CMD.pdf

[5] WHO.Dengue Guidelines For Diagnosis,Treatment,Prevention And Control.New Edition. Geneva,2009

[6] WHO.Handbook for clinical management of dengue. Geneva,2012

[7] 全国人民代表大会常务委员会.中华人民共和国传染病防治法[z].中华人民共和国主席令第十七号，2004.

[8] 国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂注册管理办法[z].国食药监械[2014]5号，2014.

[9] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 登革热诊疗指南（2014年版）[z]. 国卫办医函[2014]746号,2014.

[10] WS 216-2008，登革热诊断标准[S] 北京:人民卫生出版社,2008.

[11] 广东省卫生与生育计划委员会. 广东省登革热诊疗指引（2014年版）[z]. 粤卫办〔2014〕47号,2014.

The US FDA Related To Dengue Virus Nucleic Acid Amplification Detection Reagent Performance Requirements

WU Chuan-song Center For Medical Devices Evaluation of CFDA (Beijing 100044)

Our country often report dengue and yellow fever epidemic caused by dengue virus infection,Dengue virus nucleic acid amplification detection reagents as an important means of detection of dengue virus,The reagent performance research is very important.This paper describes the US FDA related to dengue virus nucleic acid amplification detection reagent performance requirements,For our research dengue virus nucleic acid amplification detection reagents to provide some technical ideas.

dengue virus, research performance

1006-6586(2016)07-0031-04

R446.1

A

2016-04-16