储存时间对芒草能源作物产甲烷潜力的影响

袁玲莉，王林军，刘刚金，李 超，刘研萍

(1.北京化工大学环境科学与工程系，北京 100029；2.碧普华瑞环境技术(北京)有限公司，北京 100021；3.农业部农村可再生能源开发利用重点实验室，成都 610041)



储存时间对芒草能源作物产甲烷潜力的影响

袁玲莉1，王林军2,3，刘刚金2,3，李 超2,3，刘研萍1

(1.北京化工大学环境科学与工程系，北京 100029；2.碧普华瑞环境技术(北京)有限公司，北京 100021；3.农业部农村可再生能源开发利用重点实验室，成都 610041)

芒草是一种极具开发价值的新型能源作物，芒草在用作厌氧发酵原料时，其存储时间对产甲烷潜力有一定的影响。文章将芒草收割后分别经过0，5，15，30和45 d存储，分析不同存储时间芒草的理化性质发现TS，VS，VFA，SCOD，pH值，纤维素，半纤维素，木质素，叶绿素均发生了变化，芒草的TS含量从存储时间0 d的43.92%上升到45 d的91.52%，VS含量也从0 d的41.87%上升到45 d的86.27%。对经过不同存储时间处理的芒草进行产甲烷潜力(BMP)测试，结果显示存储时间为0，5，15，30和45 d的芒草的产甲烷潜力分别为196.54，192.68，179.73，154.89和161.59 mL·g-1VS。存储时间0～30 d的BMP呈现线性下降趋势，存储时间大于30 d的理化性质和BMP趋于稳定，总体上随着芒草存储时间的延长，芒草的理化性质随之改变，产甲烷潜力随存储时间的延长而降低。

芒草；存储时间；产甲烷潜力；芒草性质

随着石化能源日益枯竭，生物质能源作为一种可再生能源越来越受到世界各国的关注。近年来，芒草作为新兴生物质原料，被全世界各研究机构进行了大量的研究。相比于第一代生物质能源，芒草具有生物质产量高、资源利用率高、生产成本低、生态适应性广、不与粮争地[1]等优点，极具开发潜力。我国是芒草资源最丰富的国家之一，多种芒草品种广泛分布于中国境内，其中又以中国芒最具应用潜力和开发价值[2]。中国芒(Miscanthussinensis)是禾本科黍亚科草本植物，东亚和东南亚到太平洋岛屿的热带、亚热带和温带地区均有分布[3]，并引入欧美地区。中国芒生命力强，对环境适应性强[4]；为多年生草本植物，一般寿命18～20年；植株高大可达数米，茎干粗壮；根系发达，抗性高，入土深度1米以上；产量可高达23～30 t·ha-1[5]。所以，中国芒作为一种高产且性能优良的新型能源作物，具有巨大的能源开发价值[6]。

目前，以芒草作为原料的能源化途径包括燃烧[7]、生物乙醇[8ˉ9]、生物甲烷[10]等，在这些能源化途径中又以生产生物甲烷利用效率最高[11]。芒草厌氧发酵生产生物甲烷主要是从发酵工艺和预处理效果评估上进行研究。主要预处理方法有：酸碱预处理、氨处理[12]、热处理[13]、爆破处理[14ˉ15]；与其他原料混合发酵[16]，如和鸡粪[17]等高含氮的物料混合发酵工艺；以及在干发酵实验中采用微曝气[19]等多种不同的发酵工艺研究；芒草的收割时间对产甲烷的影响也有相关报道[19～20]。但很少关于芒草的存储时间对其产甲烷潜力影响的研究。存储时间的长短涉及到芒草的存储成本和甲烷产量，可评估和筛选用作厌氧发酵的芒草原料，增加原料来源。同时，也能帮助沼气工厂设计原料的存储时间及存储量，方便安排沼气生产，并保证一定的产气效率，对芒草在沼气工程中的应用具有重要意义。

笔者研究了不同存储时间对芒草产甲烷潜力的影响，并通过感观及理化分析手段研究存储过程中芒草理化性质的变化与不同存储时间的芒草产甲烷潜力的关系，为后续工业应用中大规模生产生物甲烷提供原料存储时间的参考。

1 材料与方法

1.1 原料

中国芒取自中国湖南长沙湖南农业大学芒草种植园，如图1所示，于2014年10月20日收割。将芒草切碎至2～5 cm小段后混合均匀，平均分成5等份，1份置于4℃冰箱中，另外4份分别放入4个带有塑料薄膜的箱子中分别存放5 d，15 d，30 d，45 d时间，以上样品分别标记为D0，D5，D15，D30和D45。详细存放环境见表1。当到达指定存储时间后，将芒草存放入4℃冰箱中。将所有到达指定存储时间的芒草粉碎后过20目筛，作试验原料备用。各原料C/N在59～70之间。

接种泥取自北京小红门污水处理厂消化罐，TS为2.45%，VS为1.34%，pH值8.16，C/N为7.33。

图1 中国芒

存放地点白天温度夜间温度湿度℃℃RH%室内19～2315～1830～40

将接种泥在35℃环境下驯化3 d，驯化后备用。

1.2 产甲烷潜力(BMP)试验设计

试验采用自动甲烷潜力测试系统(AMPTSⅡ)进行分析，该仪器是针对BMP测试开发的专用设备，解决了BMP测试设备的测量精度和自动化问题[21]。反应体系在500 mL玻璃发酵瓶中进行，共添加接种泥和芒草400 g，接种泥与芒草的添加量之比基于各个VS含量，接种泥(gVS)∶芒草(gVS)为2∶1。装置安装个完毕后，向每个发酵瓶中通入氮气1 min，以保证反应的厌氧条件。试验在35℃条件下共运行了45 d。试验重复3次，并设置空白对照试验。各试验组别的原料和接种泥添加量见表2。

表2 沼气发酵原料和接种泥的添加量

注：试验组按不同存储时间原料(D0,D5,D15,D30和D45)命名

1.3 修正Gompertz模型拟合

使用修正后的Gompertz模型[22]对不同存储时间芒草的BMP数据进行拟合。模型如下：

其中：P(t)为累计单位VS产甲烷量，mL·g-1VS；Pmax为最大BMP，mL·g-1VS；Rmax为最大产甲烷速率，mL·d-1g-1VS；λ 为产气延迟时间，d；t为发酵天数，d。使用OriginPro8进行拟合。

1.4 分析方法及仪器

芒草TS测定用烘箱在105℃条件下将芒草烘至恒重，VS测定在马弗炉中600℃条件下焚烧芒草2.5h后称重，VS含量基于湿重计算。各原料和接种泥的总氮和总碳使用有机元素分析仪(德国，VarioEL/microcubeelementalanalyzer)测定。芒草中的酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量根据VanSoest[23]中的方法使用ANKOM2000i纤维素分析系统和200F57滤袋技术测定。酸可溶性木质素(ADL)通过重量法测定，将测定ADF后的滤袋浸泡在72%的硫酸中反应3h，洗涤至中性，放入105℃烘箱中烘干称量，最后在600℃马弗炉焚烧2.5h后称量测定。浸提法测定方法为：各取10g不同存储天数的芒草样品，加入100mL蒸馏水，4℃条件下浸泡10h后去渣，液体用于测定浸提液pH值、挥发性有机酸(VFA)和可溶性化学需氧量(SCOD)。VFA和乙醇使用气相色谱法(日本，岛津GC2014)测定，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和乙醇，以氮气为载气，FID检测器；SCOD使用COD测定仪(美国，哈希DRB200)测定。测定SCOD之前，浸提液需在10000rpm条件下离心10min取上清液通过0.45 ìm滤膜后测定。叶绿素测定，为称取0.2g粉碎样品用石英砂和碳酸钙粉研磨，加95%乙醇10mL，研磨至组织变白，暗处静置3～5min，使用乙醇润湿的滤纸过滤并用乙醇洗涤，将洗涤液全部转移到25mL棕色容量瓶中，用乙醇定容，以95%乙醇为空白，在波长665nm，649nm下测定吸光度，通过Ca=13.95A665-6.8A649，和Cb=24.96A649-7.32A665公式分别计算出叶绿素a和叶绿素b浓度，加和为总叶绿素浓度，并回算出原料干物质中的叶绿素含量。

2 结果与讨论

2.1 芒草性质随存储时间的变化

不同存储时间后，芒草的理化指标变化情况和感官性状情况分别如表3和表4所示。随着存储时间的延长，芒草的TS和VS含量从D0的43.92%和41.87%上升到D45的91.52%和86.27%，D30和D45相近。随着存储试验的进行，芒草中的水分在存储过程中损失明显，D15的水分损失率就达到了77.51%，D45水分损失率达到84.88%，水分损失导致TS和VS含量上升。而在感官性状(见表4)中，也可以明显观察到水分的下降，D15基本干燥，而D30和D45为干草样。

芒草浸提液的SCOD和VFA变化明显，D15的SCOD和VFA浓度出现一个明显地增加并达到峰值，SCOD从D0的786.60mg·L-1上升到D45的3619.71mg·L-1，VFA从217.59mg·L-1上升到726.23mg·L-1。通过观察不同存储时间的芒草感官性状(见表4)发现，D15前后是个霉菌、白腐真菌等微生物生长比较旺盛的时期，而多种微生物的作用会伴随各种可生物利用有机物较快的降解[24]，生成可溶性的物质和挥发性物质，使SCOD,VFA等成分出现大幅地增加。而浸提液的pH值变化随着存储时间的增加呈现下降趋势，pH值从D0的8.73逐步降低到D45的7.62，且前5d的存储对pH值的变化影响较大，D30以后趋于稳定。

不同存储时间下(D0～D45)，芒草木质纤维素含量占干物质比重略微上升，由于存储过程中微生物优先利用非木质纤维素成分的易降解有机物，使这些易降解有机物不断消耗，且其消耗比始终高于木质纤维素消耗比，使干物质中木质纤维素含量呈现上升趋势。而木质素含量降低明显，从初始的26.25%降低到14.99%；半纤维素无明显的变化，为28.83%～30.15%；纤维素含量呈增加趋势，从D0的24.55%增加到D45的37.40%。D0～D15随存储时间增加，芒草的腐烂程度严重，出现大量可见真菌[25]，多种真菌尤其是白腐真菌[26]是降解木质素最有效的微生物，能将木质素等彻底降解为CO2和H2O[27]，因而导致芒草在存储过程木质素的含量逐步降低。

表3 不同存储时间的芒草性质

表4 不同存储时间的芒草感官性状

通过观察可以发现(见表4)，在整个存储过程中，叶色不断变黄，到D15以后呈干黄状。通过测定各个存储天数芒草的叶绿素可知，随存储时间增加，原料干物质中的叶绿素含量从D0的0.8194 mg·g-1逐渐降低到D45的0.2906 mg·g-1，D30和D45相近。这是由于在存储过程中，叶绿素的降解导致，而叶绿素降解受到多种因素的影响：自身因素(自身代谢作用、多种叶绿素降解酶等)、环境因素(光照、氧气、温度、湿度等)[28]，叶绿素b转化为叶绿素a，经过多种酶的作用，最终降解为无色的单毗咯氧化降解产物[29]。而叶绿素含量极低，其含量和降解产物对厌氧发酵几乎没有影响。

试验结果表明，芒草在相同的环境条件下进行储存，存储时间的长短在一定程度上改变了芒草的理化性质，从而使得不同存储时间芒草的产甲烷效率可能受到影响。观察到D15以内的存储时间各性质变化比较明显，而D30和D45性质相似，可能由于极低的含水率使微生物活性大大降低，而对理化性质影响甚微。

2.2 芒草BMP随存储时间的变化

45 d的芒草产甲烷潜力(BMP)测试，发酵过程中不同存储时间芒草的单位VS累积产甲烷量和日产甲烷量分别如图2和图3所示。图2为不同存储时间下的芒草经过厌氧发酵45 d的累积产甲烷量。A-D0和A-D5的曲线基本重合，这可能由于A-D0和A-D5的各原料性状比较相似，使单位VS甲烷累积趋势的重合度较高；经过15 d，30 d和45 d存储的芒草(A-D15，A-D30，A-D45)，产甲烷速率明显下降，且累积产甲烷量也明显下降，这可能由于随着存储时间增加，芒草中的有机质不能得到很好的保存，使芒草中可被利用物质在进行产甲烷潜力测试前被损耗，使菌群可直接利用的有机物减少[30-31]。另外，甲烷发酵过程初期，发酵体系内会急剧酸化，而较高的pH值可以对这种过度酸化起到缓冲作用[32]，有利于甲烷的发酵产生。由于不同存储时间的芒草浸提液pH值随着存储时间的延长逐渐下降pH值也可能是导致芒草BMP值随着芒草存储时间的增加而降低的一个原因。A-D0，A-D5，A-D15，A-D30，A-D45的BMP分别为196.54 mL·g-1VS，192.68 mL·g-1VS，179.73 mL·g-1VS，154.89 mL·g-1VS，161.59 mL·g-1VS。BMP基本随着存储时间的增加而下降，其中A-D0和A-D5的BMP值相近；A-D15和A-D0相比，BMP已经下降了8.55%，而A-D30和A-D45的BMP值比A-D0下降了17.78%～21.19%，下降幅度明显；且A-D30以后BMP趋于稳定，说明芒草存储30 d以后对BMP影响不明显。

图3为不同存储时间芒草的甲烷日产量。试验在发酵时间0～2 d，即得到了最高甲烷日产量，这是因为试验开始时可溶性营养物质被微生物快速利用而在短时间内达到产气高峰，其中A-D0和A-D5的日产甲烷量分别在2 d和1 d达到最高，分别为14.53 mL·g-1VS和18.37 mL·g-1VS，明显高于其他存储时间的最高甲烷日产量，而A-D30和A-D45在1 d的日产甲烷量峰值仅为9.80 mL·g-1VS和10.71 mL·g-1VS，可能由于相比较其他组，A-D0和A-D5原料中的可溶物能够较快被甲烷菌利用，而A-D30和A-D45原料虽然具有较高的SCOD，但不能直接快速被甲烷菌利用，或被其他菌利用生成CO2等其他物质，也可能存在一些抑制物。在发酵5 d前后，各组均达到第二个产气高峰，日产甲烷量在12.19～12.94 mL·g-1VS之间；之后随着发酵时间的延长，日甲烷产量逐渐降低，趋于稳定。

图2 累计产甲烷量

图3 日产甲烷量

对比芒草不同存储时间组A-D0～A-D30的BMP变化趋势(见图4)和A-D0～A-D45的BMP变化趋势(见图5)，可以看出A-D0～A-D30(见图4)，BMP的下降趋势明显，且线性化程度好，R2为0.988，说明存储时间0～30 d的BMP变化基本呈现线性负相关关系。而加上A-D45(见图5)则线性化程度明显下降，主要是存储时间组A-D30的BMP和A-D45相近，说明存储时间大于30 d后BMP趋于稳定，这与理化性质变化规律一致。

试验中，原料的BMP厌氧发酵时间为45 d，但是根据计算，不同存储时间组的芒草达到本试验90%的BMP所需时间很短，分别为28，28，27，24，27 d。这意味着在实际生产应用中，仅需24～28 d，即可获得绝大部分芒草的甲烷潜力，发酵周期较短，可以降低发酵运行中的时间成本和经济成本，提高发酵罐的利用效率，提高沼气厂的经济效益，是芒草在工业应用上的一大优势。

图4 存储时间(0～30 d)和BMP变化趋势

图5 存储时间(0～45 d)和BMP变化趋势

对各存储时间芒草的BMP使用修正Gompertz模型进行拟合，各试验组拟合曲线如图6所示，拟合得到的动力学模型参数见表5。从表5可见，各试验组相关系数R均达到0.99以上，拟合度高，说明修正Gompertz模型能够较好地反应不同存储时间芒草BMP的变化规律。拟合得到的最大产甲烷潜力Pmax和试验结果基本一致，随着存储时间增加(0 ～30 d)，Pmax呈现下降趋势，A-D0和A-D5相近，A-D30和A-D45相近，存储30 d以后可认为对BMP影响不大。最大日产甲烷量Rmax基本随着存储时间增加而下降。各试验组未出现延迟时间(λ)。

图6 BMP的修正Gompertz模型拟合曲线

表5 不同存储时间的BMP修正Gompertz模型动力学参数

2.3 理化性质与BMP相关性分析

试验表明，随着存储时间的延长，芒草的BMP基本呈现逐渐降低的趋势；表3对不同存储时间芒草的性质分析表明，芒草的TS和VS等理化性质随着存储时间的延长会有不同的变化，所以存储过程理化性质改变可能是直接影响不同存储时间芒草的BMP变化的重要因素[33]。各存储时间芒草性质与BMP的相关性和显著性分析情况见表6。

其中TS，VS，木质纤维素是芒草的重要结构组成部分，这些成分的变化对纤维素原料的BMP具有一定的影响。将各存储时间芒草的TS，VS和木质纤维素性质与芒草BMP做线性回归，得出的关系图分别为图7,图8,图9。TS,VS和木质纤维素的相关性系数R(见表6)分别为：-0.8867，-0.8942，-0.7876，均呈现较好的相关关系。R值的比较可看出VS和TS在存储过程中的变化对芒草BMP的影响较大，说明TS和VS的提高直接影响了芒草BMP值，这与Long Lin[34]等的研究结果一致。而芒草BMP随着存储时间的延长而降低这一结果还需要进一步研究其他因素的影响。如环境因素：光照、温度、湿度等；性质因素：可溶性成分中的抑制物、具体可生化降解成分、厌氧过程中可生化降解部分的动态变化等；生物因素：原料中自带微生物种类、厌氧过程中微生物变化、厌氧酶活等。

表6 不同存储时间芒草性质与BMP的相关性与显著性分析

注：**为P<0.01，*为0.01

图7 TS与BMP相关性分析

图8 VS与BMP相关性分析

图9 木质纤维素与BMP相关性分析

3 结论

(1) 存储时间会影响芒草的感官性状和理化性质，存储过程中水分流失明显，木质纤维素占干物质含量略微上升，木质素含量有所下降，可能由于真菌的分解作用影响。浸提液的SCOD和VFAs从D15开始有大幅提升，而pH值随存储时间的增加呈下降趋势。叶绿素含量呈下降趋势，各理化性质存储大于D30基本趋于稳定。

(2) BMP值基本随着芒草存储时间的增加而降低。存储天数D0～D30和BMP的关系基本呈线性趋势下降，线性程度高；而存储天数大于D30的BMP趋于平稳，可能由于D30和D45各方面性质相近，BMP值也相似。不同存储时间的芒草达到BMP 90%所需的时间均不到28天，小于总反应时间的2/3，能大大提高工业化应用效率。

(3) 不同存储天数芒草的BMP受到多种性质的影响，其中TS,VS和木质纤维素含量的变化对BMP影响显著。需要进一步探究其他因素对BMP的影响。

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Effect of Storage Time on Biochemical Methane Potential of Miscanthussinensis/

YUAN Ling-li1,WANG Lin-jun2,3,LIU Gang-jin2,3,LI Chao2,3,LIU Yan-ping1/

(1.Department of Environmental Science and Engineering,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China; 2.Nova Skantek (Beijing) CO Ltd,Beijing 100012,China; 3.Key Laboratory of Rural Renewable Energy Exploitation and Utilization of Agriculture,Chengdu 610041,China)

Miscanthussinensisis one of the most valuable plants for biogas production.This study focused on the influences of different storage times (0,5,15,30 and 45 days) after harvest ofMiscanthussinensison potential methane productivity.The result showed that different storage time of 0,5,15,30 and 45 days obtained different potential methane productivity of 196.54,192.68,179.73,154.89 and 161.59 mL·g-1VS respectively,which was on a declining curve.The physiochemical parameters ofMiscanthussinensis,including TS,VS,VFA,SCOD,pH,cellulose content,hemicellulose content,lignin content and chlorophyll were analyzed.All these physicochemical properties had some changes along with the different storage time.The TS content was increased from 43.92% for 0 days of storage to 91.52% for 45 days of storage,and the VS content increased from 41.87% to 86.27%.The physicochemical properties and methane potential tended to be stable when the storage times were more than 30 days.

Miscanthussinensis; storage time; Biochemical Methane Potential(BMP); properties ofMiscanthus

2016-02-26

项目来源：农业部农村可再生能源开发利用重点实验室开放基金(2015014)

袁玲莉(1991-)，女，在读硕士，研究方向为固体废物资源化利用，E-mail：zghzyll@qq.com

刘研萍，E-mail：liushuihan@163.com

S216.4; S561

A

1000-1166(2016)03-0024-07