人胃癌SGC-7901/TCF7L2细胞株的建立及其生物学特性观察

付翠群，沈国栋，沈 干，胡世莲



人胃癌SGC-7901/TCF7L2细胞株的建立及其生物学特性观察

付翠群1,2，沈国栋1,2，沈 干1,2，胡世莲1,2

目的 建立人胃癌SGC-7901/TCF7L2细胞株，观察其生物学特性。方法 使用质粒稳定转染技术，获得高表达TCF7L2蛋白的胃癌细胞株SGC-7901/TCF7L2及其空转对照组SGC-7901细胞株(SGC-7901/CON)。采用qRT-PCR和Western blot法分别检测SGC-7901/TCF7L2和SGC-7901/CON两细胞株中的TCF7L2 mRNA和蛋白表达水平；光学显微镜下观察并比较两种细胞株的细胞形态；划痕实验比较两者的迁移能力；用细胞计数法分别检测两者对顺铂和卡铂的耐药情况；裸鼠体内荷瘤实验比较两者在体内成瘤的能力。结果 经稳定转染技术成功建立稳定的SGC-7901/TCF7L2细胞株，其TCF7L2的mRNA和蛋白表达量均较SGC-7901/CON细胞株明显升高；光镜下SGC-7901/TCF7L2细胞形态较对照细胞形态多样，伪足增多，体积增大，胞质内颗粒物质增多；迁移能力和对铂类的耐受性较对照细胞明显增强；SGC-7901/TCF7L2细胞在小鼠体内的成瘤能力也明显增强。结论 TCF7L2可以增强人胃癌细胞株SGC-7901的恶性生物学特性，SGC-7901/TCF7L2细胞株的建立为胃癌发生发展机制研究及其靶向药物开发提供基础。

胃癌；SGC-7901/CON细胞株；SGC-7901/TCF7L2细胞株；TCF7L2

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌发病率与致死率在恶性肿瘤中均居前列，严重危害人类健康[1]。早期胃癌经外科手术和药物化疗容易治愈，但目前胃癌缺乏特异有效的标志物分子，内窥镜技术接受率较低，使得我国大多数胃癌患者确诊时已经是晚期，失去了治疗的最佳时期。因此，寻找与胃癌发生发展密切相关的分子标志物，对胃癌的早期诊断和药物治疗有很重要的临床意义。已有研究[2]显示Wnt通路在结肠癌与乳腺癌等多种肿瘤细胞中呈活化状态，其中TCF7L2是该通路中的关键分子之一。该研究利用基因稳定转染技术建立高表达TCF7L2的胃癌细胞株SGC-7901/ TCF7L2，观察其生物学特性变化，为研究胃癌发生发展机制和开发靶向药物提供基础。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 RPMI-1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)；TCF7L2 兔抗 mAb、β-actin兔mAb、抗兔IgG(美国CST公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；蛋白磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂混合物(瑞士Roche公司)；显影液(上海天能科技有限公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；RNeasy mini Kit(德国Qiagen GmbH公司)；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(美国Life Technologies公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；引物TCF7L2、β-actin(日本TaKaRa公司)。

1.2 实验动物 SPF级裸鼠(BALB/c-nu)10只，雌性，6～8周龄，25 g左右，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于安徽医科大学附属省立医院SPF级动物房。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 人胃癌SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株由安徽医科大学附属省立医院分子实验室保存, 分别在含10 %小牛血清RPMI-1640完全培养基、37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行常规培养。

1.3.2 质粒稳定转染技术 转染24 h前，在30 mm培养皿中接种适量密度的SGC7901细胞(约2×105/ml)，待细胞生长面积达50%～80%时即可用于转染。配制溶液1 ∶240 μl无血清培养基+10 μl Lipofectamine 2000，室温孵育5 min；溶液2 ∶250 μl无血清培养基+2 μg TCF7L2表达质粒，室温孵育5 min；将溶液1与溶液2混合，室温下放置20 min；将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞2遍后，加入2 ml无血清培养基；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中保温4～6 h；更换含有血清的全培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，将6孔板中转染的细胞用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，按照每孔1个细胞比例稀释后加入96孔板，并加入适量purocymin进行筛选[3]，最终获得TCF7L2高表达的SGC-7901/TCF7L2细胞株和空转对照组SGC-7901/CON细胞株。

1.3.3 细胞形态学观察 应用倒置显微镜，对比观察SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株的活体细胞形态。

1.3.4 Western blot法检测 应用RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂制成的混合物裂解细胞提取蛋白，具体实验步骤见说明书；应用BCA试剂盒测蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液，于100 ℃水中煮沸5～10 min，冰上冷却上样；取出凝胶常规转膜后在5%的脱脂奶粉中封闭2 h，加1 ∶1 000稀释的β-actin兔mAb，摇床摇荡孵育4 ℃过夜，PBST漂洗过后将膜与HRP结合的二抗(抗兔 IgG)1 ∶1 000稀释室温摇荡孵育2 h[4]。然后用PBST充分洗膜后将显影液加于PVDF膜上，在显影仪上显影。

1.3.5 实时定量PCR(RT-PCR) 应用RNeasy mini Kit提取RNA，具体步骤见试剂盒说明书；核酸蛋白测定仪测定抽提RNA的浓度，根据High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit说明书操作步骤进行逆转录得到cDNA；以cDNA为模板，扩增TCF7L2片段，选β-actin作为内参[5-6]。TCF7L2上游引物：5′-AAACAGGAATCGTCCCAGAGTG-3′，下游引物：5′-CTCAGCTACGACCTTTGCTCTCA-3′；β-actin上游引物：5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，下游引物：5′-GCCGATCCACACGGAGTACTT-3′。

1.3.6 划痕实验 将SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株分别接种到6孔板中，待细胞贴壁生长至融合度约为80%时，用无菌移液器枪沿孔中轴线轻轻划过，然后用37 ℃预热的PBS洗涤细胞3次，以去除漂浮细胞，加入培养基；置37 ℃、5% CO2培养箱分别培养0、14 h后拍照，观察划痕愈合情况并测量。

1.3.7 耐药实验 收集SGC-7901/CON及SGC-7901/TCF7L2细胞株，分别制成浓度为10×104个/ml的单细胞悬液,接种于6孔板,每孔2 ml。分别加入5种不同浓度的化疗药物，即顺铂0.01、0.1、1、10、100 μmol/L,卡铂0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，每个药物浓度设2个复孔，另设2个复孔不加药物作为空白对照。37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h。用PBS洗2次，用500 μl的0.25%胰酶消化10 min，再加入500 ml PBS,用1 ml移液枪吹打均匀，在显微镜下计数，计算各组的平均值。

1.3.8 裸鼠成瘤实验 裸鼠经适应性饲养1周后进行试验。将SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株用胰酶消化后，分别制成浓度为5×106个/ml的单细胞悬液，在每一只裸鼠的左侧肋部皮下注入200 μl SGC-7901/CON的单细胞悬液，在上述裸鼠的右侧肋部皮下注入200 μl SGC-7901/TCF7L2的单细胞悬液，共接种6只裸鼠，比较SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2的肿瘤生长情况[7-8]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，多组样本均数的比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSDt检验，方差不齐者采用Games Howell检验。两组独立样本的比较，数据服从正态分布者采用独立样本t检验，若不服从正态分布者采用秩和检验，检验水准P=0.05。

2 结果

2.1 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株显微镜下形态差异 在光学显微镜下观察SGC-7901/TCF7L2细胞株和SGC-7901/CON细胞株形态差异。光镜下SGC-7901/CON细胞形态一致，呈圆形，胞质内颗粒物质较少，而SGC-7901/TCF7L2细胞形态多样，伪足增多，体积增大，胞质内颗粒物质增多，见图1。

2.2 TCF7L2在SGC-7901/TCF7L2细胞株中高表达 Western blot结果显示，TCF7L2蛋白在SGC-7901/TCF7L2细胞中的表达量较SGC-7901/CON细胞中明显升高，见图2，RT-PCR结果表明TCF7L2 mRNA在SGC-7901/TCF7L2细胞株中明显较SGC-7901/CON细胞株高表达(P=0.02)，见图3。

2.3 TCF7L2的高表达促进肿瘤细胞迁移 光学显微镜下观察显示SGC-7901/TCF7L2细胞14 h后爬行的距离明显大于SGC-7901/CON细胞株，对两者的结果进行量化，结果显示在14 h内SGC-7901/TCF7L2细胞爬行的距离明显大于SGC-7901/CON细胞株，差异有统计学意义(P=0.00)，见图4。

2.4 SGC-7901/TCF7L2细胞株对铂类化疗药物的耐受性明显强于SGC-7901/CON细胞株 耐药性实验结果表明当药物浓度<100 μmol/L时，SGC-7901/TCF7L2细胞株对顺铂和卡铂的耐药性明显强于SGC-7901/CON细胞株(P值均为0.03)，当药物浓度≥100 μmol/L时，SGC-7901/TCF7L2细胞株和SGC-7901/CON细胞株对顺铂和卡铂的耐药性无明显差异(P=0.12，P=0.16)，见图5。

图1 显微镜下观察SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞形态学差异 ×200

图2 Western blot检测TCF7L2在SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株中的表达

图3 RT-PCR检测TCF7L2 mRNA在SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞中的表达

A：SGC-7901/CON细胞株；B： SGC-7901/TCF7L2细胞株；与SGC-7901/CON细胞株比较：*P<0.05

图4 划痕实验检测SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2的转移性 ×100

A：SGC-7901/CON细胞株；B：SGC-7901/TCF7L2细胞株；1：0 h；2：14 h；与SGC-7901/CON细胞株比较：**P<0.01

2.5 SGC-7901/TCF7L2细胞株在裸鼠体内较SGC-7901/CON细胞株更易成瘤 按1.2.8项建立小鼠模型，7 d后所有接种点均成瘤，生长20 d后测量移植瘤的体积和质量，结果显示SGC-7901/TCF7L2细胞移植瘤体积较SGC-7901/CON细胞的移植瘤大(P=0.02)，质量也明显较SGC-7901/CON细胞的移植瘤重(P=0.04)，差异有统计学意义，见图6。

3 讨论

研究[9]显示在胃癌的发展过程中Wnt信号异常激活，包括Wnt表达的频率上调[10]，以及β-catenin/TCF4的核异位现象，初步确认了Wnt通路参与了胃癌的发生发展。 TCF7L2是TCF家族的一员，是Wnt通路中最为重要的下游转录因子[11]。当Wnt信号通路异常激活时，未被降解的β-catenin进入核内，与 TCF7L2的相关结构域结合形成转录复合物，并与其他转录因子相结合使下游靶基因过度表达，促进了肿瘤的发生发展[12]。 因此，TCF7L2基因的转录活性是维持细胞恶性表型所必需的，是开启下游靶基因转录的先决条件，成为了Wnt信号通路的分子开关。

图5 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株对铂类化疗药物的耐药性差异

A：细胞株对顺铂耐药实验；B：细胞株对卡铂耐药实验；与SGC-7901/CON比较：*P<0.05,**P<0.01

本研究通过质粒稳定转染技术获得稳定的SGC-7901/TCF7L2细胞株，SGC-7901/TCF7L2细胞株在形态学上较对照细胞形态多样，伪足增多，体积增大，胞质内颗粒物质增多。经RT-PCR和Western blot证实该细胞株的TCF7L2基因和蛋白表达明显增高。划痕实验证实SGC-7901/TCF7L2细胞株的迁移能力明显强于对照组细胞株。耐药试验结果显示SGC-7901/TCF7L2细胞株对铂类的耐药性明显强于SGC7901/CON细胞株，小鼠荷瘤实验表明SGC-7901/TCF7L2细胞株在小鼠体内成瘤能力较SGC-7901/CON细胞株明显增强。SGC-7901/TCF7L2和SGC-7901/CON细胞株唯一的不同就是TCF7L2基因的表达量不同，由此可以说明上述的现象是由TCF7L2基因过表达引起的。因此该研究证明TCF7L2基因可以增强人胃癌细胞株SGC-7901的恶性生物学特性。

SGC-7901/TCF7L2细胞株的建立为胃癌发生发展机制研究提供基础，也为体外研究TCF7L2在胃癌的转移、耐药以及胃癌的不良预后方面中的作用提供模型。TCF7L2可能成为胃癌患者对化疗的敏感性及不良预后的良好预测指标[13]。

图6 SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2细胞株在裸鼠体内成瘤能力的差异

A：移植瘤的最终质量；B：移植瘤的最终体积；1：SGC-7901/CON细胞株；2：SGC-7901/TCF7L2细胞株；与SGC-7901/CON细胞株比较：*P<0.05

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Establishment of the human gastric cancer SGC-7901/TCF7L2 cell line and observing its biological characteristics

Fu Cuiqun1,2, Shen Guodong1,2, Shen Gan1,2，et al

(1DeptofGeriatrics,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001;2AnhuiProvincialKeyLaboratoryofTumorImmuneandNutritionalTherapy,Hefei230001)

ObjectiveToestablishhumangastriccancerSGC-7901/TCF7L2celllineandobserveitsbiologicalcharacteristics. MethodsStableplasmidtransfectiontechniquewasusedtoobtainhighTCF7L2proteinexpressionofgastriccancercelllineSGC-7901/TCF7L2andidlingcontrolSGC-7901celllines(SGC-7901/CON).RT-PCRandWesternblotwereusedtodetectSGC-7901/TCF7L2andSGC-7901/CONtwocelllinesofTCF7L2genemRNAandproteinexpressionlevels;undertheopticalmicroscope,toobserveandcomparethemorphologicaloftwocelllines.Woundhealingexperimentswereusedtocomparetheabilityofmigrationbetweenthetwocelllines.Cellcountsweredetectedbothcisplatinandcarboplatindrugresistance.Tumor-burdenedexperimentsinnudemicewereusedtocomparetheabilityoftumorigenicitybetweentwocelllines.ResultsStablytransfectedtechnologysuccessfullyestablishedstableSGC-7901/TCF7L2cellline,whichcomparedwithSGC-7901/CONcellline,mRNAandproteinexpressionofTCF7L2amountweresignificantlyincreased;undertheopticalmicroscope,SGC-7901/TCF7L2celllinehadmorphologicaldiversity,increasedpseudopodiaandvolume,moreparticulatematterinthecytoplasmofparticulatemattercomparedwithSGC-7901/CONcellline.Migrationandtoleranceofplatinumcomparedwithcontrolcelllinewassignificantlyenhanced.ThetumorigenicityofSGC-7901/TCF7L2celllineinmicealsosignificantlyenhanced. ConclusionTCF7L2genecanenhancethebiologicalcharacteristicsofmalignantgastriccancercelllineSGC-7901.TheestablishmentofSGC-7901/TCF7L2celllineprovidesthebasisfortheresearchondevelopmentandmechanismofgastriccancer,anditisalsohelpfulforthedevelopmentoftargeteddrugs.

gastriccancer;SGC-7901/CONcellline;SGC-7901/TCF7L2cellline;TCF7L2

安徽省自然科学基金面上项目(编号：1408085MH167)；安徽省科技攻关计划项目(编号：1301042094)

1安徽医科大学附属省立医院老年病科，合肥 2300012肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室，合肥 230001

付翠群，女， 硕士研究生； 胡世莲，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail: hushilian@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.006.html

R 735.2

A

1000-1492(2016)11-1579-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.006

2016-07-04接收