复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡红细胞免疫功能影响

张桂枝，靳双星

(河南牧业经济学院 畜牧工程系,郑州 450046)



复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡红细胞免疫功能影响

张桂枝，靳双星

(河南牧业经济学院 畜牧工程系,郑州 450046)

为考察复方中药混菌发酵制剂对肉鸡红细胞免疫功能的影响，选取160只健康AA肉鸡，随机分成4组，A组为空白对照组，B组为免疫对照组，C组为复方中药制剂组，D组为复方中药混菌发酵剂组，B、C、D 3组 均在7日龄2倍量点眼滴鼻接种新城疫Lasota株Ⅳ活疫苗。分别在14、21、28和35日龄时采集血样，测定红细胞C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环率。结果表明：复方中药混菌发酵制剂在不同日龄均能提高红细胞C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环率，与空白对照组、疫苗对照组和复方中药制剂组相比存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。说明复方中药混菌发酵制剂能显著提高红细胞的免疫功能，并能克服因接种疫苗引起红细胞免疫功能短暂下降的不良反应。

复方中药；发酵；红细胞；肉鸡；免疫

有研究表明[ 1-4]许多中草药可增强红细胞免疫吸附能力，提高机体免疫调控的功能。本课题组成员根据中兽医理论及养殖业生产实际需要科学组方，研制出复方中药混菌发酵制剂。前期研究表明复方中药混菌发酵制剂能促进免疫器官的发育，增强疫苗免疫效果，增加免疫细胞数量和T淋巴细胞转化率，为进一步阐明其免疫增强作用机制，本试验通过在饲料中添加复方中药混菌发酵制剂，探讨其对AA肉鸡红细胞免疫功能的影响，旨在为临床应用及生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品

复方中药制剂：由连翘、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、枳实、山楂、甘草8味中药组成。分别于50～60 ℃下烘干2～3 h，粉碎，100%过80目筛，备用。复方中药混菌发酵制剂：取上述复方中药制剂调整物料质量含水量为50%，pH为6.0左右，使V(枯草芽孢杆菌)∶V(产朊假丝酵母)∶V(嗜酸乳杆菌)=1∶1∶1，混匀后，按质量分数为4%接种量接入物料中，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于31 ℃的环境中培养72 h，烘干，即得。

1.2 仪器和试剂

离心机、恒温水浴箱、显微镜、计数器等。酵母菌试剂、Hank’s液、家兔血清、瑞氏-姬姆萨染液等。

1.3 试验动物与设计

1日龄健康AA肉鸡，隔离饲养至7日龄，分笼饲养。选取160只体质量相近健康的AA肉鸡(雌雄各半)，随机分为4组，每组4个重复，每个重复10只鸡。A组作为空白对照组，不进行新城疫活疫苗免疫；B组为免疫对照组，C组为复方中药制剂组，D组为复方中药混菌发酵剂组，B、C、D 3组均在7日龄2倍量点眼滴鼻接种新城疫Lasota株Ⅳ活疫苗，C、D组接种疫苗的同时分别在饲料中添加质量分数为1.0%的复方中药制剂和复方中药混菌发酵剂，连续用药7 d。分别在14、21、28和35日龄时，每个重复随机抽取 2只鸡，每组8只鸡，采集心脏血液，添加质量分数为1%肝素抗凝，待检 。

1.4 红细胞C3b受体(RBC-C3bR)花环率检测

1.4.1 C3b致敏酵母悬液制备 将酵母试剂用Hank’s液(pH 7.2)洗1次(1 000 r/min离心10 min)，配成含酵母细胞1.0×108mL-1的悬液，加等量新鲜家兔血清，混匀，37 ℃水浴20 min。然后再以Hank’s液洗2次，恢复原剂量，即为C3b致敏酵母细胞悬液。

1.4.2 红细胞悬液制备 分别将上述各时间采集的肝素抗凝血2 000 r/min离心10 min，吸出上清液 ( 血浆 )，用Hank’s液洗3次(每次以2 000 r/min离心5 min)，最后将红细胞用Hank’s液稀释成细胞数为1.25×107mL-1的悬液。1.4.3 检测方法 取C3b致敏酵母菌悬浊液和红细胞悬液各50 μL，混匀，于37 ℃水浴40 min后取出，轻轻摇起，加体积分数为0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min，用适量Hank’s液稀释，涂片，干燥，甲醇固定，用瑞氏-姬姆萨染液染色，高倍镜检查。以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计数200个红细胞，计算出花环率：RBC-C3bR花环率= RBC-C3bR花环数/200 × 100% 。

1.5 红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环率检测

除酵母细胞不致敏外，其余同RBC-C3bR花环率检测。

1.6 统计分析

采用SPSS 12.0中 One-Way ANOVA过程进行单因素方差分析数据，并进行Duncan’s多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 复方中药混菌发酵制剂对肉鸡RBC-C3bR花环率的影响

由表1可知，免疫后第7天，C、D组高于空白对照A组，但无显著性差异(P>0.05)；B组显著低于A组(P<0.05)；C、D组极显著高于B组(P<0.01)。免疫后第14天，B组高于A组，但差异不显著(P>0.05)；C、D组极显著高于A、B组(P<0.01)，D组显著高于C组(P<0.05)。免疫后第21天，B组显著高于A组(P<0.05)，C、D组极显著高于A、B组(P<0.01)。D组显著高于C组(P<0.05)。免疫后第28天，B、C、D组极显著高于A组(P<0.01)，C、D组显著高于B组(P<0.05)，C、D组之间没有显著差异(P>0.05)。

表1 不同处理RBC-C3bR花环率的动态变化

注: 同列数据后不同小写字母者表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下表同。
Note: Different lowercase and capital letters after values within columns mean different at 0.05 and 0.01 significant level,respectively. The same as below.

2.2 复方中药混菌发酵制剂对肉鸡RBC-IC花环率的影响

由表2可知，免疫后第7天，C、D组显著高于A组(P<0.05)，极显著高于B组(P<0.01)；A组显著高于B组(P<0.05)。免疫后第14天和免疫后第21天，C、D组均极显著高于A、B组(P<0.01)，A组与B组之间无显著差异(P>0.05)，免疫后14天，D组显著高于C组(P<0.05)。免疫后第28天，C、D组极显著高于A组(P<0.01)，显著高于B组(P<0.05)，B组显著性高于A组(P<0.05)，但C、D 组之间无显著差异(P>0.05)。

表2 不同处理RBC-IC花环率的动态变化

3 讨 论

发酵是中药材传统炮制方法之一。现代发酵研究表明[5-7]，微生物具有氧化、酯化、甲基化、羟基化、还原化等多种能力，中草药经发酵后，其有效成分能被充分释放，使其具有更强的生物活性，并含有大量的活性酶，饲喂后能被机体组织细胞迅速吸收，达到调节免疫，增强抗病力的功能，更好地发挥中草药的药效作用。同时，还可以将某些成分分解转化成新的成分，这些新成分成为增强药理作用或出现新药理作用的物质基础。因此，可以利用其进行发酵制药，从而降低用药成本，提高功效。

众多研究表明[8-10]，红细胞作为机体天然免疫的重要组成部分，不仅能够运送氧气和二氧化碳，而且具有识别、储存和提呈抗原、清除循环免疫复合物、促进吞噬细胞吞噬、增强T细胞和NK细胞活性等作用。红细胞在体内广泛参与非特异性和特异性免疫反应[11]。红细胞的粘附活性可作为评价红细胞免疫功能的重要指标，免疫黏附功能是通过C3b受体实现的，并发现血液C3b受体总数的95%以上都在红细胞上[12]。红细胞的这些免疫功能主要是通过免疫黏附来实现，郭峰等[13]在红细胞免疫的基础理论和应用研究方面取得了许多突破性进展，建立了一系列红细胞免疫功能的监测方法。RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率高低可作为红细胞免疫粘附功能的重要指标[14]。

许多中药复方制剂和多糖可显著提高红细胞免疫水平[15-16]。本试验研究结果表明，饲料中添加复方中药混菌发酵制剂，在不同日龄均能不同程度提高RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率，与空白对照组、免疫对照组和复方中药制剂组相比存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)，这可能与复方中药混菌发酵过程中其有效活性成分能被充分释放，产生大量的生物活性酶和新成分有关。这与乔海博等[8]、韩春杨等[14]结果相一致。

健康鸡经新城疫活疫苗免疫后，RBC-C3bR花环率和RBC-IC花环率与对空白照组相比短暂性降低，说明用新城疫活疫苗免疫会引起机体红细胞免疫功能短暂性下降，这可能是新城疫活疫苗毒株进入机体后破坏血液中红细胞膜上的C3b受体所致。红细胞C3b受体分子是相对分子质量约为200 000的糖蛋白，极易受到各种抗原的危害。

以上结果表明，说明复方中药混菌发酵制剂能显著提高红细胞的免疫功能，并能克服因接种疫苗引起红细胞免疫功能短暂下降的不良反应。

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(责任编辑：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Effect of Mixed Culture Fermentation of Compound Chinese Herbal Medicine Mixtures on the Immune Function of Erythrocyte in AA Broilers

ZHANG Guizhi and JIN Shuangxing

(Animal Science Department,Henan Univeisity of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In order to study the effects of the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures on the immune function of erythrocyte in broilers.160 healthy chicken broilers at the age of 7 day old were selected,randomly divided into 4 groups:normal control group(A),infected control group(B),compound Chinese herbal medicine mixtures group(C) and mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures(D).B,D and C groups were inoculated with 2 times ND Lasota Ⅳ vaccine by means of eye and intranasal at the age of 7 days,and blood specimen was collected at the 14th,21st,28 th and 35th days respectively to detect the broilers’ rosette formation rates of RBC-C3bR and RBC-IC. The results showed that the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures could increase the broilers’ rosette formation rates of RBC-C3bR and RBC-IC at different ages.The rates were significantly higher than the normal control group,infected control group and compound Chinese herbal medicine mixtures group(P<0.05 orP<0.01). The experiment indicated that the mixed culture fermentation of compound Chinese herbal medicine mixtures can improve the immune function of erythrocyte in broilers and overcome the erythrocyte immune function of falling short due to the vaccination by-effects.

Compound Chinese herbal medicine;Fermentation; Erythrocyte; Broiler; Immune

ZHANG Guizhi,female,associate professor.Research area:prevention and control of the disease in livestock and poultry.E-mail:zhangguizhi666@126.com

JIN Shuangxing,male,professor.Research area:prevention and control of the disease in livestock and poultry.E-mail:jinshuangxing@126.com

2015-06-18

2015-09-02

河南省科技攻关计划项目(142102110044)；河南牧业经济学院科技创新团队项目(HUAHE2015003)。

张桂枝，女，副教授，研究方向为畜禽疫病防控。E-mail: zhangguizhi666@126.com

靳双星，男，教授，研究方向为畜禽疫病防控。E-mail: jinshuangxing@126.com

日期：2016-10-20

S853.72

A

1004-1389(2016)10-1454-04

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.010.html

Received 2015-06-18 Returned 2015-09-02

Foundation item Science and Technology Planning Project of Henan Province(No.142102110044);Innovative Research Team of Henan Univeisity of Animal Husbandry and Economy(No.HUAHE2015003).