纳豆芽孢杆菌发酵豆渣营养成分变化研究

周亚楠，柴贺，初琦，朴春红，王玉华，于寒松，刘俊梅，代伟长

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

纳豆芽孢杆菌发酵豆渣营养成分变化研究

周亚楠，柴贺，初琦，朴春红，王玉华，于寒松，刘俊梅，代伟长

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

研究纳豆芽孢杆菌发酵豆渣后营养成分变化情况。将湿豆渣调整水分，灭菌，冷却后接入不同浓度的纳豆芽孢杆菌，37℃下发酵22h，4℃下后熟22h后，对其粒径分布、营养成分、氨基酸含量、蛋白降解程度、部分抗营养因子指标进行测定。结果表明：豆渣经纳豆芽孢杆菌发酵后粒径变小、渣感减弱、口感明显得到改善。粗蛋白、粗纤维等常规营养成分无显著变化；水溶性蛋白、水溶性纤维、多糖、小肽含量显著提高（P<0.05）；氨基酸组分上，豆渣发酵后缬氨酸、甲硫氨酸等必需氨基酸含量均有显著提高（P<0.05）；豆渣风味品质得到明显改善；胰蛋白酶抑制剂活性和植酸含量均有显著下降（P<0.05）。豆渣经纳豆芽孢杆菌发酵后营养价值和风味品质得到一定程度的提高，同时降低抗营养因子，为纳豆杆菌发酵豆渣的可行性提供理论参考。

豆渣；发酵；纳豆芽孢杆菌；营养成分

豆渣是豆腐、豆奶等大豆制品加工中的主要副产物，约占全豆干重的15%～20%[1]，目前国内大豆食品行业每年约生产4 000万t湿豆渣[2]。由于其保质期短、口感粗糙、豆腥味较重，加工性能较差、几乎无市场价值，往往只能作为工业废渣和饲料处理。近年来大量研究发现，通过微生物发酵可以使豆渣的很多性能得

到改善[3]。发酵后的豆渣不仅具有抗氧化、降低血液中胆固醇含量、减少糖尿病患者对胰岛素的消耗等功效[4]；还可以改善豆渣口感、风味、延长保质期、减少资源浪费、环境污染等，从而极大提高了其综合利用价值。

目前，发酵豆渣常用的微生物种类繁多，有应用毛霉、黑曲霉、米曲霉等单一菌株为接种液进行发酵[5]，也有以酵母、米曲霉等混合菌株为接种液进行发酵[6]，经发酵后豆渣的很多性能均得到很好的改善。纳豆芽孢杆菌是从日本的传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的一种益生菌，属细菌科、芽孢杆菌属。经研究发现：纳豆芽孢杆菌具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能，使发酵产品中富含氨基酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，因而对于发酵豆制品来说，纳豆芽孢杆菌是一种非常重要的发酵剂。此外，纳豆芽孢杆菌在发酵产品的属性、功能特性及风味品质上也同样起到重要的作用。但是目前对于纳豆芽孢杆菌的研究主要集中于纳豆及相关产品的研发和成分分析，而对纳豆芽孢杆菌发酵豆渣营养成分变化尚没有系统化研究。本研究以纳豆芽孢杆菌为发酵菌株对副产物豆渣进行发酵，研究发酵前后营养成分变化情况，旨在为副产物豆渣的高效利用及工艺研究提供理论参考，同时为进一步促进豆渣食品产业化进程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与仪器

新鲜豆渣：吉林农业大学食品生物反应器与功能性食品研究室自制；菌种：纳豆芽孢杆菌由林农业大学食品生物反应器与功能性食品研究室分离并保存。

1.1.2 试剂

石油醚（沸程：30℃～60℃）、苯酚、浓硫酸、碘化汞、3、5-二硝基水杨酸试剂、葡萄糖、氢氧化钠、重蒸酚、亚硫酸氢钠、酒石酸钠（均为分析纯）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.1.3 仪器与设备

AUY220分析天平、UV-1700紫外分光光度计：日本岛津公司；YXQ-LS-75G立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗器械厂；101A-2电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；DSY-2-4电热恒温水浴锅：北京国华医疗器械厂；3K15离心机：美国Sigma公司；DG-800旋涡混合器：北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Hanon K1100全自动定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豆渣发酵

等分称取新鲜豆渣6份，调整水分含量至75%，121℃、灭菌20min，冷却至40℃，按每100 g湿豆渣分别接种5、10mL接种活化好的菌液浓度为107/mL纳豆芽孢杆菌液后，37℃前期发酵22 h，置于4℃后熟22 h，将样品取出后，121℃灭菌20min，真空冷冻干燥备用。其中以不接种菌液作为空白对照组，其它条件均一致。

1.2.2 粒度分布测定

分别取8 g发酵和未发酵豆渣，置于三角瓶中，按相同比例加水混合后，进行超声处理，促使颗粒分散（超声处理可能造成豆渣颗粒破碎的影响可忽略不计）。将处理后的样品置于摇床中，40℃、150 r/min振荡3 h，使豆渣颗粒均匀分散，随后倒入依次叠好的标准套筛中进行筛析（叠放次序由上至下，筛孔直径分别为：1 500、900、450、200、30μm标准检验筛），用蒸馏水冲洗每层筛豆渣颗粒5min，依次将筛上残留豆渣颗粒分别转入事先编号的称量皿中，于烘箱中105℃烘干至恒重，称取重量并分别计算质量分数（%），由此依次求出0～30、（＞30）～200、（＞200）～450、（＞450）～900、（＞900）～1 500、＞1 500μm颗粒质量分数（%）。

1.2.3 一般营养成分测定

灰分含量参照GB/T 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分含量的测定》，采用高温灼烧法进行测定；蛋白含量测定参照GB/T 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》方法进行；粗脂肪含量测定参照GB/T5009.6-2003《食品中粗脂肪的测定》方法进行；膳食纤维含量测定参照GB/T5009.88-2008《食品中膳食纤维的测定》方法进行；粗蛋白体外消化率的测定参照李清晓等[7]方法进行测定；采用邻苯二甲醛法[8]对小肽含量进行测定；胰蛋白酶抑制剂活性测定参照卢晓凌等[9]方法进行；植酸含量测定参考Ling JF[10]等方法进行；采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的组成和含量。

1.2.4 蛋白降解程度分析

准确称取（1.0±0.01）g豆渣样品，加入30mL丙酮，室温搅拌30min～50min后，9000 r/min离心15min，去除上清液，将样品置于通风橱内，挥去残留丙酮，干燥备用。参照Lim等[11]方法进行SDS-PAGE凝胶电泳法。

1.3 数据处理

本试验采用Microsoft Excel2007软件对所得数据结果进行统计；运用SPSS软件进行显著性分析。结果图均用SigmaPlot软件绘制。

2 结果与分析

2.1 粒径分布比较分析

豆渣发酵前后粒径分布如图1所示。

图1 豆渣发酵前后粒径分布Fig.1 Particle sizedistribution of bean residuebeforeand after ferm ention

由图1可知，未发酵豆渣的粒径主要集中在（＞450）～900、（＞900）～1500和＞1 500μm之间，其中在0～30μm尺寸的颗粒仅占17.5%。而发酵后的豆渣粒径则主要分布在0～30μm之间，占总颗粒的85%以上，（＞900）μm～1 500μm和＞1 500μm颗粒几乎不存在，即经发酵的豆渣与未发酵的豆渣相比，其豆渣颗粒明显变小。对于感觉敏感的人，口腔可感知的颗粒最小尺寸为20μm～30μm。由于＞30μm的豆渣颗粒的减少，使发酵后豆渣的渣感显著降低，更容易吞咽。

2.2 常规营养成分分析

豆渣发酵前后粗灰分、粗蛋白、可溶性多糖等常规营养成分测定结果见表1。

表1 豆渣发酵前后常规营养成分分析Table1 The conventionalnutrient com position analysisofbean residuebeforeand after fermention %

由表1可知豆渣发酵前后粗灰分、粗蛋白、总纤维等常规营养成分无显著变化，而发酵豆渣的粗脂肪、可溶性多糖、可溶性纤维含量均显著提高（P＜0.05）。当接种量为5%和10%时，粗脂肪增加31.44%和35.83%，可溶性多糖增加393.33%和364.00%，可溶性纤维则增加102.43%和125.35%，不同接种量之间无显著差异。

2.3 氨基酸组分分析

通过氨基酸自动分析仪测得豆渣发酵前后氨基酸的组分如表2所示。

表2 豆渣发酵前后氨基酸（AA）含量变化Table2 Theam ino acid（AA）contentsof bean residuebeforeand after ferm ention%

豆渣经发酵后，部分氨基酸组分、总必需氨基酸含量均发生显著变化（P＜0.05）。当接种量为5 mL/100 g时，谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及总必需氨基酸含量分别提高了14.71%、68.42%、40.00%、58.82%、31.34%和13.81%；当接种量为10%时分别提高了23.11%、78.95%、60%、147.06%、89.55%和30.03%，均高于接种量为5%的发酵豆渣；发酵后只有丝氨酸出现显著下降，当接种量为5%和10%时，分别下降了23.53%和47.06%；半胱氨酸等11种氨基酸含量无显著变化。

2.4 蛋白质品质变化

试验分别对豆渣发酵前后可溶性蛋白和小肽含量指标进行了测定，具体结果见表3，并结合SDSPAGE凝胶电泳对豆渣发酵前后蛋白降解程度进行分析（图2）。

表3 豆渣发酵前后蛋白品质变化Table3 Theprotein qualityofbean residuebeforeand after ferm ention

图2 发酵豆渣SDS-PAGE电泳图谱分析Fig.2 SDS-PAGE electrophoresisprofileof the fermented bean residues

由表3可知，按不同的接种量发酵豆渣后可溶性蛋白、小肽含量均有显著增加（P<0.05）。当接种量为5mL/100 g时，分别增加了128.83%和438.57%；接种量为10mL/100g时则分别增加了144.58%和443.57%，而不同接种量之间无显著差异。由图2可知，未发酵豆渣中大分子蛋白居多，但豆渣发酵后，蛋白质分子量基本都集中在14.4 ku以下，充分表明豆渣中大分子蛋白已被降解，这与表3结果趋势基本一致。

2.5 抗营养因子活性分析

原豆渣中抗营养因子残留较高。但经发酵后发现胰蛋白酶抑制剂活性和植酸含量均显著下降（P< 0.05），特别是当接种量为10mL/100 g的发酵豆渣，胰蛋白酶抑制剂活性变成17.27 TIU/g，仅为原豆渣胰蛋白酶抑制剂活性的1%，且植酸未检测出（见表4）。

3 讨论

豆渣由于口感粗糙、蛋白质分子结构紧密、颗粒较大，同时含有一些抗营养因子，不利于营养物质的消化吸收。将豆渣用微生物进行发酵可以改变营养物质化学结构，其中部分抗营养因子得到有效的减少或消除，大分子蛋白得到不同程度的降解[12]，同时豆渣的渣感降低，吞咽难易程度得到改善[13]。随着微生物发酵的发展，为使用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣改善其营养特性提供了可能性。本试验选用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣，与未发酵豆渣相比，发酵豆渣粒度分布改变，颗粒减小，渣感降低。ZhuYunping[14]等在用枯草芽胞杆菌属发酵豆渣的研究中也发现枯草芽孢杆菌发酵能改善豆渣的口感，这一点与本研究相一致。

表4 豆渣发酵前后抗营养因子活性变化Table4 Theanti-nutritional factorsactivity of bean residue beforeand after fermention

在常规营养成分分析中发现，发酵后的豆渣粗蛋白、总纤维、粗灰分含量均无显著变化，但是粗脂肪、可溶性多糖、可溶性纤维含量显著提高。特别指出的是，发酵豆渣粗脂肪含量显著增加，为30.4%，这可能是在发酵过程中，豆渣的营养成分降解后会产生一些小分子物质（如：醇和酸），同时氨基酸在酸的作用下可能会变成醇，醇和酸发生酯化反应，化合为酯，使得石油醚提取物质量增加，从而导致粗脂肪含量相对增加；可溶性多糖、可溶性纤维含量的显著提高则与纳豆芽孢杆菌产酶体系有关。纳豆芽孢杆菌是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和糖化酶等。纳豆芽孢杆菌发酵豆渣过程中产生的复合酶不仅可以降解大量纤维素生成单糖物质，使可溶性碳水化合物递增，同时还可以将不溶性纤维相关组分转化为可溶性，提高其含量。而可溶性多糖和可溶性纤维含量的增加不仅有利于改善豆渣的口感和风味，还会增加豆渣的细腻程度。豆渣发酵后氨基酸组成发生一定变化，其中谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量均有不同程度提高，而其它氨基酸及总氨基酸含量均无显著变化，这可能是由于在发酵过程中，豆渣中氨基酸组分发生转氨及合成作用所致。杨学娟[15]在用纳豆芽孢杆菌发酵低温豆粕的功能活性和机制研究中发现纳豆芽孢杆菌发酵豆粕后天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸明显增加，和本试验研究结果相类似。

纳豆芽孢杆菌发酵过程中分泌的蛋白酶是一类

内切酶，它能有效水解大豆蛋白，生成大量的大豆多肽。王阳等[16]利用纳豆芽孢杆菌发酵大豆，并以大豆蛋白水解率为指标，研究纳豆芽孢杆菌对大豆蛋白水解作用，发现在最佳条件下大豆蛋白水解率达到44.4%。本试验表3及SDS-PAGE电泳图谱的结果表明豆渣在纳豆芽孢杆菌所分泌的蛋白酶作用下，部分水不溶性蛋白转变成水溶性蛋白，把大分子量的蛋白降解成为营养价值更高、更容易被吸收利用的小分子量的多肽，并且经发酵后的蛋白质分子量主要集中在14.4 ku以下，这可能是因为不同微生物产酶体系不一样，从而水解程度也不同，这和前人研究的结果基本类似[17]。

豆渣中含丰富的蛋白质，同时也存在多种抗营养因子，例如胰蛋白酶抑制剂、植酸等典型代表。它们的存在对生物体内某些消化酶起抑制作用，与营养物质络合成不易消化的成分，使得豆渣的消化率和动物的吸收率下降。本试验豆渣经不同接种量纳豆芽孢杆菌发酵后胰蛋白酶抑制剂活性显著降低，说明胰蛋白酶抑制剂在发酵的过程中被有效的降解。姜丹等[18]研究发现用酵母发酵大豆后植酸降解率可达到80.11%。而本研究中显示用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣后植酸的降解率基本上达到了100%，这可能是由于纳豆芽孢杆菌发酵过程中产生的复合酶对植酸的分解具有协同作用，从而提高植酸的降解率。

4 小结

豆渣经纳豆芽孢杆菌发酵后粒径变小，渣感减弱，大分子蛋白被分解，必需氨基酸含量提高，抗营养因子基本被降解，豆渣的营养品质得到了充分提高。该工艺的研究为提高豆渣综合利用价值和生产高品质豆渣食品提供新思路与理论参数。

[1]高金燕.豆渣的营养与药用价值[J].中国食品与营养,2003(11): 49-50

[2]Liu X B,Jin J,Wang G H,et al.Soybean yield physiology and developmentofhigh-yielding practices in NortheastChina[J].Field Crops research,2008,105:157-171

[3]李艳芳,郝建雄,程永强,等.黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感[J].农业工程学报,2012,28(7):248-253

[4]Fujita T,Funako T,Hayashi H.8-Hydroxydaidzein,an aldose reductase inhibitor from okara fermented with Aspergillussp.HK-388 [J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2004,68(7):1588－1590

[5]王慧,刘莹,胡博涵,等.豆渣不同菌种发酵后成分变化的研究[J].现代食品科技,2013,29(6):1277-1280

[6] 徐媛.固态发酵法改变豆渣加工性能的研究[D].长春:吉林农业大学,2012

[7]李清晓,李忠平,庄苏,等.豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究[J].家畜生态学报,2005,26(5):28-31

[8]Estefania Gonzalez-Garcia,M.Luisa Marina,M.Concepcion Garcia. Plum (PrunusDomestica L.)by-productasanew and cheap source of bioactive peptides:Extraction method and peptides characterization[J].Journalof Functional Foods,2014,11:428-437

[9]卢晓凌.大豆中抗营养因子脲酶和胰蛋白酶抑制剂不同测定方法的比较[D].哈尔滨:东北林业大学,2008

[10]Ling JF,HAan BZ,RObertNountM J,etal.Effectsofsoaking,germination and fermentation on phytic acid,total and in vitro soluble zinc in brown rice[J].Food Chemistry,2008,11(4):821-828

[11]Lim JY,Kim JJ,LeeDS,etal.Physicochemical characteristicsand production of whole soymilk from Monascus fermented soybeans. Food Chemistry,2010,120(1):255-260

[12]Juan M Y,Wu CH,Chou CC.Fermentationwith Bacillus spp.asa bioprocess to enhance anthocyanin content,the angiotensin converting enzyme inhibitory effect and the reducing activity of black soybeans[J].Food Microbiology,2010,27(7):918-923

[13]Rhyu M R,Kim EY.Umami taste characteristicsofwater extractof Doenjang,a Korean soybean paste:low-molecular acidic peptides maybeapossible clue to the taste[J].Food Chemistry,2011,127(3): 1210-1215

[14]Zhu Yunping,Yin Lijun,Cheng Yongqing,et al.Effects of sources ofcarbon and nitrogen on production ofα-glucosidase inhibitorbya newly isolated strain ofBacillussubtilisB2[J].Food Chemistry,2008, 109(4):737－742

[15]杨学娟.纳豆芽孢杆菌固体发酵低温豆粕的功能活性及机制研究[D].南京:江苏大学,2013

[16]王阳,张景,陈聪,等.纳豆芽孢杆菌液态发酵产低分子大豆蛋白肽的工艺优化[J].大连工业大学学报,2012,31(3):161-164

[17]Teng D,Gao M,Yang Y,et al.Bio-modification of soybean meal with Bacillus subtilis or Aspergillus oryzae.Biocatalysis and AgriculturalBiotechnology,2012,1(1):32-38

[18]姜丹,丁洪浩,张晶,等.发酵对豆粕中营养物质和抗营养因子的影响[J].中国兽医学报,2011,31(4):579-582

The Variable Pattern of Nutrition Com ponents in Bacillus natto Fermentation of Bean Residue

ZHOUYa-nan，CHAIHe，CHUQi，PIAOChun-hong，WANGYu-hua，YUHan-song，LIU Jun-mei，DAIWei-chang
（Instituteof Food Scienceand Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China）

In the present study，bacillus natto was used to fermented bean residue，fermented bean residue of the contents of nutrition componentswas investigated.Themoisture ofwet bean residue was adjusted，sterilized，cooleddown to room temperature，the bacillus natto seed culture was incubated to the sterilized bean residue and incubated at37℃for 22 h，after-mature cultivated at4℃for 22 h.The particle size distribution，conventional nutritional components，amino acid contents，protein degradation degree，some anti-nutritional factorsof fermented bean residuewere analyzed，respectively.The resultsshowed the taste sense that the particle sizebecame smallerwassignificantly improved after fermentation.Crude protein，crude fiber，ash and other nutrients had no significant differences，the contents of the water-soluble protein，water-soluble fiber，polysaccharidesand smallpeptide levelswere significantly increased（P<0.05）.The contentsofsome amino acid ofbean residuewere changed，compared with non-fermented bean residue.The essentialamino acids contents including valine，methionine，phenylalanine of fermented bean residue both were significantly improved（P< 0.05）.Additionally，the trypsin inhibitor activity and phytate content of fermented bean residue were significantly decreased.The study indicated that bacillusnatto fermentation significantly improved nutrition and flavor components of bean residue，the partial amino acid component contents and the nutritional valuewere significantly increased，anti-nutritional factorswere degraded and itprovided a theoretical refeen for the feasibility of bean residue fermented by bacillusnatto.

bean residue；fermention；bacillusnatto；nutrition components

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.040

2016-01-21

现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（CARS-04）；吉林省科技厅科技创新人才培养计划“吉林省农产品副产物高附加值开发研究团队”（20160519013JH）

周亚楠（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：发酵微生物的选育与代谢调控。

*通信作者：朴春红（1972—），女（朝鲜），教授，博士，研究方向：生物反应器与功能性食品。