高压脉冲电场辅助提取葛花黄酮工艺优化

代名君，尤丽新，文连奎，*，殷涌光

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.长春科技学院生物食品学院，吉林长春130600；3.吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022）

高压脉冲电场辅助提取葛花黄酮工艺优化

代名君1，尤丽新2，文连奎1，*，殷涌光3

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.长春科技学院生物食品学院，吉林长春130600；3.吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022）

以乙醇为溶剂，采用高压脉冲电场辅助提取葛花黄酮，以黄酮得率为指标，在单因素试验的基础上，利用响应面法考察乙醇浓度、料液比、电场强度、脉冲数对葛花黄酮得率的影响并确定最佳工艺条件。试验结果表明：乙醇浓度60%，料液比1∶32（g/mL），电场强度16 kV/cm，脉冲数8个，此时黄酮得率为10.373%。

高压脉冲电场；提取；葛花；黄酮

葛花（Pueraria lobata）为豆科植物葛的干花蕾，又名葛条花，是我国的传统药物[1]。葛花性味甘凉，含有黄酮类、皂苷类、甾醇类、香豆素类以及生物碱类等活性成分，并含有多种无机元素及挥发油成分。研究表明，葛花具有解酒醒脾[2]，降血糖降血脂[3-4]、改善学习记忆等功效[5-6]。葛花中的黄酮类、皂苷类等有效成分具有良好的生理活性[7]，在免疫系统及内分泌系统中发挥协调作用，可有效改善因酒精引起的新陈代谢异常等情况。

传统工艺对葛花黄酮的提取方法有：有机溶剂提取法[8-9]、微波辅助提取法[10]、超声波提取法[11]。高压脉冲电场是一种具有非热特性的新型技术，它穿透力强，对食品处理均匀、彻底[12-13]，因在常温常压条件下，可通过瞬时破壁使细胞膜通透性发生变化，从而使物质溶出，故可利用其提取植物有效成分[14]，但未见高压脉冲电场提取葛花黄酮的报道。本文采用高压脉冲电

场法提取葛花黄酮，并对葛花黄酮的提取工艺进行了优化，从而保留黄酮的生物活性，以期为合理利用葛花资源及功能性保健食品的研发，提供科学的数据，奠定坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛花：市售无霉变干制品；鸢尾苷标准品：阿拉丁试剂（上海）有限公司；无水乙醇：北京化工厂。

1.2 主要仪器与设备

高压脉冲电场设备：吉林大学研制；JY92-II超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外可见分光光度计（UV2100型）：UNICO公司；大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有点公司；YD4002型电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；HH-4A数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高压脉冲电场法提取葛花黄酮得率的测定

1.3.1.1 标准曲线的绘制

准确称取5mg鸢尾苷标准品，用70%乙醇配制成浓度为200μg/mL鸢尾苷标准溶液，准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL棕色容量瓶中，用70%乙醇溶液定容刻度，以70%乙醇溶液为空白对照样，在266 nm处测定吸光度。

1.3.1.2 葛花黄酮得率的计算

将经过提取的葛花溶液加入60%乙醇溶液定容于100mL，离心分离后，取适量溶液进行稀释后，按照标准曲线的制作方法测定样品的吸光度值，并根据公式（1）计算葛花黄酮得率。

式中：Y为葛花黄酮得率，%；C为根据样品吸光度值在标准曲线上计算得到的葛花黄酮含量，μg/mL；V为葛花提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为葛花质量，g。

1.3.2 高压脉冲电场提取葛花黄酮试验设计

1.3.2.1 单因素试验设计

1）乙醇浓度对葛花黄酮得率的影响：在料液比为1∶30（g/mL），电场强度为15 kV/cm，脉冲数为8个的条件下，考察乙醇浓度为50%、55%、60%、65%、70%时对葛花黄酮得率的影响。

2）料液比对葛花黄酮得率的影响：在乙醇浓度为60%的条件下，设定电场强度为15 kV/cm，脉冲数为8个进行试验，考察料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）时对葛花黄酮得率的影响。

3）电场强度对葛花黄酮得率的影响：当乙醇浓度为60%，料液比为1∶30（g/mL）时，将脉冲个数设定为8个进行试验，考察电场强度为5、10、15、20、25 kv/cm时对葛花黄酮得率的影响。

4）脉冲数对葛花黄酮得率的影响：在乙醇浓度为60%，料液比为1∶30（g/mL），电场强度为15 kV/cm的条件下，考察脉冲数为4、6、8、10、12个时对葛花黄酮得率的影响。

1.3.2.2 响应面优化试验设计

在单因素试验基础上，采用四因素三水平Box-Behnken试验设计方法，选取最优水平进行响应面分析，以葛花黄酮得率为考核指标，确定最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以鸢尾苷标准溶液的浓度为横坐标，以吸光值A为纵坐标，制得标准曲线如图1所示，回归方程为Y= 0.063 2X-0.020 9，R2=0.998 3。

鸢尾苷标准曲线见图1。

图1 鸢尾苷标准曲线Fig.1 Standard curve for tectoridin

2.2 单因素试验结果及分析

2.2.1 乙醇浓度对葛花黄酮得率的影响

乙醇浓度对葛花黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.2 Effectsof theethanolconcentration rateon total flavonoids yield

由图2可知，当乙醇浓度为60%时，葛花黄酮的得率最高。适当的乙醇浓度可以加速葛花黄酮的溶出，但当乙醇浓度高于60%时，黄酮得率反而有所降低，再综合考虑试剂浪费等问题，因此，选择乙醇浓度55%～65%为最适范围。

2.2.2 液料比对葛花黄酮得率的影响

液料比对葛花黄酮得率的影响见图3。

图3 液料比对黄酮得率的影响Fig.3 Effectsof the stuff-liquid ratio rateon total flavonoidsyield

由图3可知，葛花黄酮得率随着料液比的升高而增大，当液料比为1∶30（g/mL）时，葛花黄酮得率最高，随后得率基本稳定。适当料液比可以加速葛花黄酮的溶出，这可能是因为随着料液比的增加，使得葛花粉与溶剂接触面的浓度差增大，因此提高了传质速率[15]。但当料液比高于1∶30（g/mL）时黄酮得率增减幅度减小，随后不再增加，再综合考虑能源消耗等问题，因此选择料液比为1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）为最适水平范围。

2.2.3 电场强度对葛花黄酮得率的影响

电场强度对葛花黄酮得率的影响见图4。

图4 电场强度对黄酮得率的影响Fig.4 Effectsof theelectric field intensity rateon total flavonoids yield

适当的外加电场作用，可以降低细胞膜的保护作用，使其结构紊乱，从而致使细胞膜破裂，提高通透性[16]。由图4可知，随着电场强度的增加，葛花黄酮的得率升高，当电场强度为15 kV/cm时，黄酮得率达到最大值。这是由于极性溶剂随着电场强度增加，运动速度加快，使更多的溶剂进入到细胞内，从而细胞内的物质能够更容易地渗透出来；另一方面可能是因为物料间内外的电场强度差异作用使得细胞膜被破坏[17]，细胞穿孔，葛花中的黄酮物质更易溶出。但随着电场强度的增大，葛花黄酮的得率反而有所下降，这可能是由于过大的电场强度使得黄酮结构发生了破坏，并且场强过大对机器有一定的损害，可能会有打火现象的发生。

2.2.4 脉冲数对葛花黄酮得率的影响

脉冲数对葛花黄酮得率的影响见图5。

图5 脉冲数对黄酮得率的影响Fig.5 Effectsof theelectric pulsenumber rateon total flavonoidsyield

图5 可知，当脉冲数为8个时，葛花黄酮得率最大。脉冲数过小，对细胞的破坏程度不明显，不利于黄酮的溶出，得率低。增大脉冲数，电场的作用频率增强，使得细胞的破坏程度与数量增大，得率升高。但脉冲数过大，由于电场对物料作用频率过大，时间过长，产生了不稳定因素，使得黄酮结构发生变化，从而影响葛花黄酮得率。

2.4 高压脉冲电场提取葛花黄酮工艺优化

2.4.1 数学模型的建立与方差分析

通过单因素试验，应用Box-Behnken中心组合进行四因素三水平的试验设计，试验因素及水平安排见表1根据中心组合试验与Box-Behnken试验设计原理[18]，得响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3，可信度分析结果见表4。

表1 响应面分析因素和水平表Table1 The tableof factorsand levelsused in response surface analysis

根据Design-Expert软件，对结果进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到以黄酮得率为目标函数，进行方差分析及显著性检验，得到各条件编码

值的二元回归方程为：

表2 响应面试验结果Table2 Resultsof corresponding experimental

表3 回归模型的方差分析Table3 Varianceanalysis for the developed regressionmodel

续表3 回归模型的方差分析Continue table3 Varianceanalysis for the developed regression m odel

表4 回归模型的可信度分析Table4 Reliability analysisof theestablished regressionmodel

对响应面结果进行回归分析，各因素对试验的影响是否显著可以通过P[19]值确定。由上述表中结果可知，回归方差分析显著性检验表明，该模型（P＜0.000 1）具有高度显著性，说明该模型成立，该模型的失拟项（P=0.071＞0.05）并不显著，说明模型与真实情况之间无显著性差异，这两者同时表明该模型的拟合性较好。上述回归方程的相关系数为R2=0.985 7，说明模型与实际拟合较好，该试验方法可靠[20]。该模型的变异系数C.V.%=0.76，说明该模型的重复性良好。在回归模型中，一次项A、B、C、D，交互项AC、AD、BC、BD、CD，二次项A2、B2、C2、D2均表现出了显著水平。通过F值的比较，得出该模型各因素对响应值影响的显著性大小为：料液比＞电场强度＞乙醇浓度＞脉冲数，两两交互作用对黄酮提取影响大小为AD>BC>AC>BD>CD>AB。2.4.2 各因素的交互作用对葛花黄酮提取的响应面分析

各因素之间两两交互作用见图6。

图6 三因素的交互作用Fig.6 Respanse surfacechartof three factors

由图6中可以看出各图均成开口向下、凸形的曲面，并且都具有极值。由a可以看出，乙醇浓度（A）和料液比（B）等高线成圆形，说明两者之间交互作用不显著，在试验范围内随着乙醇浓度（A）和料液比（B）的不断增大，黄酮得率均呈现先增大后减小的趋势。从图中可以看出当乙醇浓度（A）在59%～61%、料液比（B）为1∶31（g/mL）～1∶33（g/mL）时黄酮的得率达到峰值。b、d、e、f等高线均成椭圆形，说明两两交互作用极为显著，并且黄酮得率随着各因素值的不断增大，均先增大后减小。由c可以看出，乙醇浓度（A）和脉冲数（D）交互作用较显著，随着两者不断增大，黄酮的得率呈现先增大后小。当乙醇浓度（A）处于较低水平时，黄酮得率随着脉冲数（D）的增长不断提高。当乙醇浓度超过60%以后，黄酮得率虽然随着脉冲数（D）的增大而增加，但增加的幅度较小，当乙醇浓度（A）处于高水平时黄酮的得率有所下降。当脉冲数（D）较小时，得率随着乙醇浓度（A）的增大而增加，当脉冲数（D）高于9以后，得率随着脉冲数（D）的增加变化幅度逐渐变小。

2.4.3 响应面优化最佳工艺参数

通过响应面法对试验数据进行优化后，通过分析可以得出葛花黄酮提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度60.59%料液比1∶32.18（g/mL），电场强度16.66 kV/cm，脉冲数8.58个，此时黄酮得率为10.455%。

2.4.4 验证试验

为了验证试验结果与实际情况是否一致，根据模型所给出的试验方案进行验证性试验，考虑试验的方便情况，对结果进行取整后得到的最佳工艺参数为：乙醇浓度60%、料液比1∶32（g/mL），电场强度16 kV/cm，脉冲数8个。在此条件下，实际测得的葛花黄酮得率为10.373%，理论值为10.455%，相差0.082%，因此，利用响应面法对葛花黄酮提取条件进行优化是可行的，得到的葛花黄酮提取条件具有实际的应用价值，为实际操作提供技术参考。

3 结论

高压脉冲电场提取葛花黄酮具有能耗小、时间短、对热敏性物质的破坏程度较小等优点。以葛花为原料，利用高压脉冲电场技术提取葛花黄酮，通过响应面试验，确定最佳提取条件为：乙醇浓度60%，料液比1∶32（g/mL），电场强度16 kV/cm，脉冲数8个，得率为10.373%。

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Technology Optim ization of Total Flavonoids Extraction from Pueraria lobata by the High-intensity Pulsed Electric Fields Assistance

DAIMing-jun1，YOU Li-xin2，WEN Lian-kui1，*，YINYong-guang3
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.College ofOrganism and Food，Changchun University ofScience and Technology，Changchun 130600，Jilin，China；3.Collegeof Biologicaland AgriculturalEngineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

Pueraria lobata wasused as rawmaterial toextract total flavonoidsby thehigh-intensity pulsed electric fields，with theyield of total flavonoidsas index，based on thissingle factorexperiment，the effectsofstuffliquid ratio，electric field intensity，and electric pulse number on the yield of total flavonoidswere discussed by respons surfacemethodology，and determined the bestextraction process parameters of these three factors.The results showed that，themost yield rate 10.373%by total flavonoidswas achieved under the following conditions theethanolconcentrations60%，ratioofstuff-liquid ratio1∶32（g/mL），electric field intensity16 kV/cm，electric pulsenumber8.

high-intensity pulsed electric fields；extraction；Pueraria lobata；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.023

2016-02-23

吉林省教育厅“十二五”科学技术项目：葛花解酒饮品的开发研究（[2012]第517号）

代名君（1988—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：农产品加工。

*通信作者：文连奎（1962—），男，教授，研究方向：长白山野生资源的开发利用。