酵母菌絮凝作用在甜叶菊苷提取工艺中的应用

李夏

（四川化工职业技术学院，四川泸州646000）

酵母菌絮凝作用在甜叶菊苷提取工艺中的应用

李夏

（四川化工职业技术学院，四川泸州646000）

以啤酒酵母菌悬液作为絮凝剂对浸提液进行絮凝，根据文献资料选择啤酒酵母培养时间、絮凝剂用量、温度、助凝剂种类、CaO投加量、pH值这几个因素进行单因素试验，最后以浸提液澄清率和甜叶菊苷损失率作为评价指标，分别考察啤酒酵母在各因素不同水平下对甜叶菊苷浸提液的絮凝作用。结果表明，CaO投加量这一个因素对絮凝效果的影响最为显著，其次为絮凝剂的用量，pH、温度变化对絮凝效果影响不太显著，且酵母菌絮凝效果最佳的组合为：絮凝剂用量4.8mL，pH值为5，CaO投加量为450mg/L，絮凝温度为30℃，此时甜叶菊苷提取液吸光度为0.204、澄清率为78.5%、损失率为16.54%。

絮凝条件；絮凝效果；絮凝剂；酵母菌；化学絮凝剂

絮凝是酵母的可遗传特性之一，絮凝特性受自身絮 凝 基 因（FLO1、FLO2、FLO4、FLO8、FLO5、FLO9、FLO10为显性，FLO3为半显性）控制，其中FLO1、FLO2、FLO4、FLO8为等位基因，故不同菌种的酵母，其絮凝性不同[1]。甜叶菊苷是一种性能优良的甜味剂，其甜度为蔗糖甜度的近300倍，其食品安全性很高，并具有降低血压的作用，是理想的高甜度、低热量、口味好、防龋齿，对糖尿病和高脂血症有很好疗效的一种新型甜味剂，应用前景十分广泛。

本文围绕酵母的絮凝特性对比现工业上提取甜叶菊苷广泛采用的化学絮凝剂，提出酵母絮凝剂的影响因素及最佳絮凝条件，展望酵母絮凝剂的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

甜叶菊干叶：市售；酵母液体培养基：微生物实验室自制；NaOH 1mol/L、HCl1mol/L、50%CaO溶液：生物化学实验室自配。

SHZ-D（III）型抽滤机：中浮仪器设备有限公司；752N型分光分度计：上海天翔光学仪器有限公司；SPX-150恒温生化培养箱：上海丙林电子科技有限公司；pH S-25数显酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；TD5G台式过滤离心机：上海赵迪生物科有限公司；JH-12型恒温加热器：成都市科恒达仪器设备有限

责任公司；HH-4数显恒温水浴锅：上海蓝凯仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸取液的制备

在1 000mL烧杯中加入适量去离子水（为原料的10倍），加热至沸，加入甜叶菊干叶70 g，搅拌使干叶完全浸泡在沸水中，然后蒸煮40min。冷却到室温，过滤，得到黑褐色初提液。滤渣再连续提取2次（每次加300mL自来水，蒸煮20min）。过滤后将3次提取液合并，总体积约1 000mL。

1.2.2 培养基的制备

取市售大麦150 g，洗净后浸泡12 h，放置在阴暗处覆盖湿润的纱布使其发芽（温度为室温），直至麦根长出，长度达到麦粒的两倍长后，停止发芽并将麦芽摊开晒干。待将干麦芽磨碎、称重，按照麦芽和水1∶4（g/mL）的比例混合，同时加入淀粉酶，65℃水浴糖化3 h。向糖化好的麦芽汁中加水20mL，然后将糖化液煮沸（注意要一边搅拌一边煮），过滤后加入2%琼脂，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，制备得到的即为麦芽汁培养基。

1.2.3 菌种培养及处理

将活化的菌种（市售啤酒酵母）按2%的比例进行接种后至于摇床中，于35℃，120 r/min的条件下进行培养。发酵液2 000 r/min的条件下离心5min，保留菌体洗涤，此时得到较纯的啤酒酵母菌体总共用200mL，将啤酒酵母分散到发酵液1/2体积的蒸馏水中，在振荡器上振荡混匀制得啤酒酵母菌悬液作为啤酒酵母絮凝剂。

1.2.4 甜叶菊苷样品液的制备

称取甜叶菊苷标准品10mg，放置在10mL的容量瓶中，用去离子水将甜叶菊苷溶解并稀释到10mL，摇匀，制成1mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

1.2.5 甜叶菊苷的测定及损失率的计算[4-5]

甜叶菊苷测定及损失率计算参照多糖测定方法：苯酚-硫酸比色法及损失率计算方法：

量取提取液和絮凝后的样品液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，苯酚-硫酸比色法测定甜菊苷的含量，损失率P按下式计算：

式中：P为损失率；C0、C1分别为提取液和样品溶液中甜菊苷的含量，单位为mg/mL。

1.2.6 澄清率的计算[6-7]

以蒸馏水做参比，测定甜叶菊提取液在670 nm处的吸光度A0及样品溶液在上述波长处的吸光度A1，澄清率B按下式计算：

1.2.7 酵母菌絮凝条件的确定

1.2.7.1 酵母菌絮凝单因素试验

1）发酵时间对絮凝效果的影响

菌种培养24 h后每隔12 h进行取样，测定不同的发酵时间对啤酒酵母絮凝效果的影响，共取样9次，取样按1.2.3的方法对啤酒酵母菌种进行处理，将处理后的菌悬液分别添加在装有20mL甜叶菊苷浸取液的试管中，水浴35℃下絮凝20min，计算甜叶菊苷的损失率和絮凝后浸提液的澄清率。

2）酵母菌投加量对澄清效果的影响

取甜叶菊苷粗体液20mL，分别加入絮凝剂酵母菌混悬液 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.0、4.6、5.2 mL在pH 5.0，水浴35℃下絮凝20min.计算澄清率和甜叶菊苷损失率。

3）CaO添加量对絮凝效果的影响

取5只试管，加入甜叶菊苷粗提液20mL，酵母絮凝剂3.6mL，分别加入浓度各为150、300、450、600、750mg/L的CaO溶液。调整絮凝溶液pH值至5.0、35℃条件下水浴20min进行絮凝。

4）絮凝温度对絮凝效果的影响试验

取甜叶菊苷粗提液20mL，加入絮凝剂3.6mL，调整pH 5.0，水浴温度分别为20、25、30、35、40、45、50℃，絮凝20min。

5）pH对絮凝效果影响的试验

取甜叶菊苷粗提液20mL，加入絮凝剂3.6mL，在35℃，pH值分别为1、2、3、4、5、6、7、8条件下水浴20min。

1.2.7.2 正交试验

根据单因素试验，得出絮凝剂最佳用量范围、最适温度差以及助凝剂的投放范围，在此基础上设立正交试验。其中各因素和水平见表1。

表1 酵母菌絮凝正交试验各因素及水平Tab le1 Yeast flocculation orthogonalexperiment factorsand levels

2 结果与分析

2.1 酵母菌絮凝法单因素试验结果

2.1.1 培养时间对絮凝效果的影响结果

培养时间对絮凝效果的影响结果见表2。

表2 培养时间对絮凝效果的影响Table2 Theeffectof incubation tim eon flocculation

结果可以看出，随着培养时间的延长，啤酒酵母的絮凝活性逐渐升高，当培养48 h后，啤酒酵母的絮凝活性达到49.16%。此后澄清率变化不再显著增加，几乎稳定。江慧华等和郭旭辉等的研究中，筛选得到的微生物达到最大絮凝活性的时间为分别在培养后的56 h和60 h。均高于本试验中啤酒酵母达到最大值絮凝效果的时间。所以，试验中得出的啤酒酵母较短的培养时间以及较稳定的絮凝活性使得该菌在实际生产中具有非常大的优势。

2.1.2 酵母菌投加量对澄清效果影响试验结果

酵母菌投加量对澄清效果的影响见表3。

表3 酵母菌投加量对澄清效果的影响Table3 Theeffectof dosing quantity of yeaston clarification

结果可看出，随着絮凝剂投加量的增多，测得吸光度逐渐增大，但当絮凝剂投加量达4.8mL时，又呈现下降状态，20mL甜叶菊浸取液加入4.2mL絮凝剂时，吸光度达到最低并趋于稳定。

2.1.3 CaO对絮凝效果的影响试验结果CaO对澄清效果的影响见表4。

表4 CaO对澄清效果的影响Table4 Theeffectof CaO on clarification

可以看出，选用GaO做助凝剂，随着Ca2+浓度的增大，钙桥作用明显，酵母菌的自絮凝作用随之加强。酵母菌的絮凝效果随Ca2+浓度变化稳定。但随着金属离子的增多，酵母菌的絮凝作用也会相应的呈现抑制作用，因此在扩大絮凝时也应当相应考虑这一点。

2.1.4 絮凝温度对絮凝效果的影响试验结果

絮凝温度对絮凝效果的影响见表5。

表5 絮凝温度对絮凝效果的影响Table5 fTheeffectof floccu lation temperatureon floccu lation

可以看出温度对啤酒酵母的絮凝性影响较大，当温度在20℃～35℃范围内时，甜叶菊浸提液澄清升高；当温度超过35℃后，絮凝活性下降，说明菌株所产絮凝剂的絮凝活性受温度影响显著。

2.1.5 pH值对絮凝效果影响试验结果

pH值对絮凝效果的影响见图6。

表6 pH值对絮凝效果的影响Table6 Theeffectof pH on floccu lation

可以看出在pH3～5范围内时，啤酒酵母的絮凝性较好，甜叶菊苷浸提液的澄清率较高；酸碱值超过此

范围，絮凝活性有所下降，说明菌株所产絮凝剂的絮凝活性受pH影响较显著，分析絮凝剂中的有效絮凝物质可能带有一定的电解性，絮凝剂的电解程度及其带电荷的性质与絮凝效果关系密切。

2.1.6 酵母菌絮凝正交试验结果

酵母菌絮凝正交试验结果见表6。

表6 酵母菌絮凝正交试验结果Table6 Yeast flocculation orthogonalexperim ent results

通过正交试验，得出了啤酒酵母菌絮凝甜叶菊苷浸提液的最优因素和水平组合为A3B3C2D1，即：絮凝剂用量4.8mL，pH为5，CaO投加量为450mg/L，絮凝温度为30℃，啤酒酵母絮凝效果最好。

由于正交试验的9组试验中没有A3B3C2D1组合，因此按照最优方案A3B3C2D1组合进行验证，所得数据为：吸光度0.204、澄清率78.5%、损失率16.54%。

2.2 化学絮凝法澄清试验结果[2]

对比文献资料，使用化学絮凝剂在取得相近澄清效果的条件下（化学絮凝法78.48%，啤酒酵母絮凝法78.5%），两者甜叶菊苷的损失率差异明显（化学絮凝法19.24%，啤酒酵母絮凝法16.54%）。因此，啤酒酵母絮凝法能有效地保留溶液中的有效成分，投加量少，并且安全无毒，完全可以使用啤酒酵母替代传统化学絮凝剂。

3 讨论

现工业中使用的大部分絮凝剂会改变甜叶菊苷的风味、甚至有些絮凝剂对人体健康有一定的危害，在絮凝的过程中也会引入大量的杂质，为下游加工处理带来麻烦，处理费用也比较大。本试验针对啤酒酵母的絮凝作用，采用啤酒酵母作为絮凝剂，探讨啤酒酵母对甜叶菊苷提取液的絮凝效果及影响啤酒酵母絮凝作用的因素，寻找啤酒酵母最佳的絮凝条件组合。经过试验，确定了啤酒絮凝的最佳条件组合为絮凝剂用量4.8mL，pH值为5，CaO投加量为450mg/L，絮凝温度为30℃，此时甜叶菊苷提取液吸光度为0.204、澄清率为78.5%、损失率为16.54%，同时按照试验确定的最佳组合进行了小试生产试验，试验结果证明，啤酒酵母确实具有较强的絮凝能力，在实验确定的最佳条件组合下，其对甜叶菊苷浸提液的澄清率均稳定在70%以上，虽然与目前工业上使用的絮凝剂相比，效果稍差，但是无毒无害、可食用、易回收是啤酒酵母在食品添加剂制备领域的突出优点。且甜叶菊苷具有不可发酵性，絮凝过程中残存的啤酒酵母不易在产品中生存、发酵，对产品质量及保质期没有影响，这也说明，甜叶菊苷自身性质决定了其非常适合使用微生物絮凝剂进行絮凝纯化。

[1]Luan J,Zhao C X.The research progress of yeast flocculation in advance[J].The food and fermentation industry,2008,12:139

[2]Xie J,Liu X J.Water extract and clarify themechanism of chitosan clarification stevia[J].Food science,2011,10:2

[3]Zhang LH,Hou X F.Regulating calcium levels,improve the state of yeast flocculation[J].wine,2008,9:63-64

[4]WeiX J,Xiang FC.Iron amaranth polysaccharide extraction process optimization[J].Anhuiagriculturalscience,2012,40(34):16548-16551

[5]HanW,Zhang L L.Mulberry polysaccharideof flocculating purification and its oxidation resistance[J].Journal of nanjing university of technology(naturalscienceedition),2014,1:97-98

[6]MORAESEDP,MACHADONRCF．Clarificationof Steviarebaudiana (Bert．)Bertoniextractby adsorption inmodified zeolites[J]．ActaScientiarum Universidade EstadualdeMaringa,2001,23(6):1375-1380

[7]SILVA FV,BERGAM ASCOR,ANDRADECM G,etal．Purificationprocess of stevioside using zeolites and membranes[J]．InternationalJournalofChemicalReactor Engineering,2007(5):7

[8]Zhang X Y,Xu ZW,ZanY,etal．Steviawater extraction liquid of flocculation[J]．Modern food scienceand technology,2006,23(2):8-10

The Application Technology of Yeast Flocculant in Extracting Stevioside

LIXia
（Sichuan ChemicalVocational TechnicalCollege，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Yeastbacteria suspension was used as flocculant to extract.The literature flocculant dosage，temperature，CaO dosing quantity，pH numerical single factor experiments，extract absorbance，clarify rate and loss rateofsteviaglycosideswere choosed asevaluation index，to investigate the factorsunder different levelsof steviaglycosidesextractsof flocculation.The resultsshowed that the CaO dosingquantitywas the significant factors，the dosageof the flocculatingagent，pH，temperature changewerenotsignificant factoron the flocculation performance.The best combination of the yeast flocculation effectwas as follows：flocculant dosage 4.8 mL，pH 5，CaO dosing quantity 450 mg/L，flocculation temperature of 30℃，the stevia glycosides extracts absorbancewas0.204，clarification rateof78.5%，loss ratewas16.54%.

flocculation conditions；flocculation effect；flocculant；yeast；chemical flocculant

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.017

2016-02-23

李夏（1984—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：微生物、生物化学。