脐橙皮中黄酮的超声波辅助双水相提取工艺研究

汪建红，匡晨

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川内江641112）

脐橙皮中黄酮的超声波辅助双水相提取工艺研究

汪建红1，2，匡晨1

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川内江641112）

以低温烘干的脐橙皮为原料，利用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取脐橙皮中的黄酮。通过单因素试验和正交试验，考察了乙醇浓度、硫酸铵用量、超声波处理温度、超声波处理时间、液料比、回流提取温度、回流提取时间等因素对黄酮提取效果的影响。结果表明，最适宜的提取条件为：乙醇浓度40%，硫酸铵用量8 g，超声波处理温度50℃，超声波处理时间50min，液料比25∶1（mL/g），回流提取温度60℃，回流提取时间3 h。在此条件下做了4次平行试验，平均得率可达8.173%，远高于相同条件下超声波非双水相法、双水相非超声波法和非超声波非双水相法，而且试验重现性好。

脐橙皮；黄酮；双水相；超声波；提取

脐橙是一种美味可口、营养丰富的水果，因其独特的口味，深受人们喜爱，也催生了脐橙加工产业的蓬勃发展[1-2]。但在生产加工和食用过程中，脐橙皮往往作为垃圾被直接抛弃，既污染了环境，又浪费了资源。脐橙皮中含有丰富的生物活性成分，特别是黄酮[3]。黄酮具有消炎、抗菌、抗氧化、抗癌等生物活性，引起了

很多人的关注[4-5]。

黄酮类化合物常用的提取方法有有机溶剂法[6]、酶法[7-8]、微波法[9]、超临界法[10]、超声波辅助法[11-12]、双水相法[13-14]等。有机溶剂法操作简便，但条件较为苛刻、黄酮得率较低，且还可能使用有毒溶剂。酶法操作条件温和，得率也较高，但酶易失活。微波法时间短，提取效率较高，但微波可能会破坏黄酮分子结构和给人体带来负面影响。超临界法得率较高，但设备复杂，成本较高。超声波辅助法条件温和，快速高效。双水相法是一种新的提取方法，操作简便，条件温和，提取效率较高，且提取物活性损失小，且后处理容易。因此，本文综合超声波法和双水相法的优点，选择超声波辅助双水相法提取脐橙皮中的黄酮。

常用的双水相体系较多，乙醇-硫酸铵双水相体系分相容易，且避免了高分子双水相体系黏度大、难处理的缺点，也不使用有毒有害溶剂[15]。因此本文选择超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取脐橙皮中的黄酮，并优化其提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

DFT-100型100克手提式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FA2204A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；CS101-2AB型电热鼓风干燥箱：中华人民共和国重庆试验设备厂；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：上海兴创科学仪器有限公司；722N型可见分光光度计：上海菁华科技仪器公司；759S型紫外-可见分光光度计：上海棱光技术有限公司。

脐橙皮：购自重庆奉节；芦丁标准品为优级纯；无水乙醇、硫酸铵、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

测定波长的选择：参照文献方法[13]以30%的乙醇为溶剂配制0.20mg/mL的芦丁标准溶液，然后准确移取1.00mL于带刻度试管中，加入显色剂显色，在300 nm～600 nm范围内利用紫外-可见分光光度计进行扫描，发现510 nm处出现强吸收峰，因此选择510 nm为测定波长。

标准曲线的绘制：参照文献方法[13]，利用上述0.20 mg/mL的芦丁标准溶液分别配制0.008、0.016、 0.024、0.032、0.040、0.048 mg/mL的芦丁标准溶液，并分别先后加入5%的亚硝酸钠溶液、10%的硝酸铝溶液、4%的氢氧化钠溶液显色，在510 nm波长位置测吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 黄酮的提取与测定

称取2.00 g脐橙皮粉于250mL圆底烧瓶中，按照设定的液料比（V乙醇溶液：m脐橙皮粉）、乙醇浓度和硫酸铵用量加入乙醇溶液和硫酸铵固体，先按照设定的超声波功率、处理温度、处理时间处理，再移去超声波按照设定的回流温度，回流提取一定时间，过滤，将滤液在容量瓶中稀释至100mL，放置备用[13]。

参照文献方法[13]，准确移取1.0mL上述提取液于100mL容量瓶中，用30%乙醇溶液定容；再从中准确移取1.00mL于50mL容量瓶中，定容；从中取出1.00mL样品溶液于25mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液6.00 mL，摇匀，放置15min，再在510 nm处测其吸光度值，根据标准曲线回归方程，得到被检测的提取液浓度。总黄酮得率按照下式计算：Et/%=（C×V×n）/W× 100，式中Et为得率，%；C为测得的提取液浓度，g/mL；n为稀释倍数，W为原料的质量，g；V为测得的提取液体积，mL。

1.2.3 乙醇浓度对黄酮得率的影响

在硫酸铵用量、液料比、超声波功率、超声波处理温度、超声波处理时间、回流提取温度、回流提取时间分别为8 g、10∶1（mL/g）、160W、40℃、20min、40℃、2 h的条件下，选择不同乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%），重复1.2.2的操作。

1.2.4 硫酸铵用量对黄酮得率的影响

在1.2.3确定的乙醇浓度，和液料比、超声波功率、超声波处理温度、超声波处理时间、回流提取温度、回流提取时间分别为10∶1（mL/g）、160W、40℃、20min、40℃、2 h的条件下，选择不同硫酸铵用量（6、8、10、12、14 g），重复1.2.2的操作。

1.2.5 超声波处理温度对黄酮得率的影响

在1.2.3和1.2.4确定的乙醇浓度和硫酸铵用量，及液料比、超声波功率、超声波处理时间、回流提取温度、回流提取时间分别为10∶1（mL/g）、400W、20min、40℃、2 h的条件下，选择不同超声波处理温度（30、40、50、60、70℃），重复1.2.2的操作。

1.2.6 超声波处理时间对黄酮得率的影响

在1.2.3、1.2.4和1.2.5确定的乙醇浓度、硫酸铵用

量、超声波处理温度，及液料比、超声波功率、回流提取温度、回流提取时间分别为10∶1（mL/g）、400W、40℃、2 h的条件下，选择不同超声波处理时间（20、30、40、50min），重复1.2.2的操作。

1.2.7 液料比对黄酮得率的影响

在1.2.3、1.2.4、1.2.5和1.2.6确定的乙醇浓度、硫酸铵用量、超声波处理温度、超声波处理时间，及超声波功率、回流提取温度、回流提取时间分别为400W、40℃、2 h的条件下，选择不同液料比即V乙醇溶液：m脐橙皮粉（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）），重复1.2.2的操作。

1.2.8 回流提取温度对黄酮得率的影响

在1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6和1.2.7确定的乙醇浓度、硫酸铵用量、超声波处理温度、超声波处理时间、液料比，及超声波功率、回流提取时间分别为400W、2 h的条件下，选择不同回流提取温度（30、40、50、60、70℃）下，重复1.2.2的操作。

1.2.9 回流提取时间对黄酮得率的影响

在1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6、1.2.7和1.2.8确定的乙醇浓度、硫酸铵用量、超声波处理温度、超声波处理时间、液料比、回流提取温度及超声波功率为400W的条件下，选择回流提取时间（1、2、3、4、5 h），重复1.2.2的操作。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

芦丁标准曲线如图1所示。

图1 标准曲线Fig.1 The standard curve

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

乙醇体积浓度对脐橙皮中黄酮提取效果的影响如图2所示。

图2 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.2 Effectsof theethanolconcentration on yield of flavonoid

从图2可知，随乙醇浓度的增加，黄酮得率呈先增加后减少的趋势；当达到40%时，黄酮得率达最大值。这是由于黄酮在乙醇中溶解度远大于水中，乙醇浓度的增加也导致双水相上层乙醇浓度的增加，因此有利于黄酮的溶解浸出；但乙醇浓度过大时也会增加脂溶性杂质的浸出，反过来抑制黄酮的提取，综合考虑，选择最佳乙醇浓度40%。

2.2.2 硫酸铵用量对黄酮得率的影响

硫酸铵用量的影响如图3所示。

图3 硫酸铵用量对黄酮得率的影响Fig.3 Effectsof theamountof ammonium sulfateon yield of flavonoid

从图3可知，在6 g～10 g范围内，黄酮得率随硫酸铵用量的增加而增加，当硫酸铵用量达到10 g时，达最大值，此后随着硫酸铵用量的增加，黄酮得率逐渐下降。这是由于硫酸铵用量的增加增强了双水相体系的分相能力，导致体系上层乙醇浓度增加，有利于黄酮的浸出，但硫酸铵用量过大时，双水相体系稳定性遭到破坏，会有较多晶体析出，同时上层乙醇浓度增加也会导致脂溶性杂质析出的增加，抑制黄酮的提取。因此综合考虑，选择最佳硫酸铵用量10 g。

2.2.3 超声波处理温度对黄酮得率的影响

超声波处理温度的影响如图4所示。

图4 超声波处理温度对黄酮得率的影响Fig.4 Effectsof theultrasonic treatm ent temperatureon yield of flavonoid

从图4可看到，随超声波处理温度的增加，黄酮得率呈先增加后减少的趋势；当温度达到50℃时，得率达最大值。这是由于超声波处理温度越高，超声波对脐橙皮组织的破壁能力越强，越有利于黄酮的浸出，但过高的温度也会导致被超声波分解变质的黄酮的量增加。综合考虑节能和得率，选择最佳超声波处理温度50℃。

2.2.4 超声波处理时间对黄酮得率的影响

超声波处理时间的影响如图5所示。

图5 超声波处理时间对黄酮得率的影响Fig.5 Effectsof theultrasonic treatment timeon yield of flavonoid

从图5可知，随着超声波处理时间的延长，黄酮得率先增加后减少，当达到30min时，得率达最大值。这是由于时间越长，超声波对脐橙皮组织的破壁程度越大，越有利于黄酮的浸出，但处理时间过长时，被超声波破坏的黄酮的量也逐渐增加。综合考虑，选择最佳超声波处理时间为30min。

2.2.5 液料比对黄酮得率的影响

液料比即V乙醇溶液：m脐橙皮粉对黄酮提取效果的影响如图6所示。

从图6可知，随着溶剂用量的增加，黄酮得率先逐渐增加，后又逐渐下降，当液料比达到20∶1（mL/g）时，得率达最大值。这是由于溶剂越多，能溶解的黄酮越多，越有利于黄酮的浸出，但溶剂量的增加也增加了浸出的脂溶性杂质的量，抑制了黄酮的提取，也是对试剂的一种浪费。综合考虑，选择最佳液料比为20∶1（mL/g）。

图6 液料比对黄酮得率的影响Fig.6 Effectsof the liquid-solid ratio on yield of flavonoid

2.2.6 回流提取温度对黄酮得率的影响

回流提取温度对黄酮提取效果的影响如图7所示。

图7 回流提取温度对黄酮得率的影响Fig.7 Effectsof the reflux extraction temperatureon yield of flavonoid

从图7可知随着回流提取温度的上升，黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，回流提取温度60℃时为黄酮得率的峰值位置。这是由于随着回流提取温度的上升，黄酮分子变得更活跃，更有利于进入溶剂，但过高的回流提取温度也会增加被氧化变质的黄酮的量。综合考虑选择60℃为最佳回流提取温度。

2.2.7 回流提取时间对黄酮得率的影响

回流提取时间对黄酮提取效果的影响如图8所示。

从图8可看到，随着回流提取时间的延长，黄酮得率逐渐增加，当3 h时达最大值，此后随回流提取时间的继续延长，黄酮得率却呈逐渐下降的趋势。这是由于开始时溶剂中的黄酮浓度较小，远未达到饱和；当回流提取时间达到3 h时，溶剂中黄酮量接近于饱和，继续延长时间不但不会浸出更多的黄酮，还会导致被氧化变质的黄酮的量的增加。综合考虑，选择最佳回

流提取时间为3 h。

图8 回流提取时间对黄酮得率的影响Fig.8 Effectsof the refluxing extraction timeon yield of flavonoid

2.3 正交试验

参照单因素试验的结果，在超声波功率、回流提取温度、回流提取时间分别为400W、60℃、3 h的前提下，以乙醇浓度、硫酸铵质量、超声波处理温度、超声波处理时间和液料比，5个因素为考察因素，每个因素选取4个水平，设计了L16（45）正交表来安排试验，每组试验条件作了3次平行试验，其结果如表1和表2所示。

表1 L16（45）正交试验设计及结果Table1 L16（45）orthogonalexperimentaldesign and results

表2 正交试验结果方差分析Table2 Varianceanalysisof theorthogonalexperiment results

从表1可看出，脐橙皮中黄酮的得率受到了乙醇浓度、硫酸铵质量、超声波处理温度、超声波处理时间和液料比5个因素的交叉影响，各影响的主次次序为液料比>超声波处理时间>乙醇浓度>超声波处理温度>硫酸铵用量。最佳水平组合为A2B2C4D3E2，即：乙醇浓度40%，超声波处理温度50℃，超声波处理时间50min，液料比25∶1（mL/g），硫酸铵用量8 g。

为了进一步确定试验因子的可信度，对脐橙皮中黄酮得率的正交试验结果的方差分析见表2。从表2可看到，在脐橙皮黄酮所选择提取工艺的正交试验所选取的因素和水平范围内，因素C和D即超声波处理时间和液料比达到了显著水平，而因素A、B、E即乙醇浓度、超声波处理温度、硫酸铵用量对脐橙皮中黄酮提取的影响不显著。而F值结果表明，方差分析结果与直观的极差分析结果一致。

对正交试验结果进行4次平行试验验证，结果脐橙皮中黄酮得率分别为8.121%、8.207%、8.087%、8.276%，平均值为8.173%，说明了正交试验结果的正确性。

2.4 几种提取方法的比较

表3列举了相同条件下几种提取方法提取脐橙皮中黄酮的情况。

表3 几种提取方法下的黄酮提取情况Table3 Theextraction effectsof flavonoid by severalkindsof extractingmethods

从表3可知超声波辅助双水相的方法获得的黄酮得率远大于其它几种方法，因此声波辅助双水相提取黄酮确实是一种很有发展前途的提取方法。

3 结论

本文通过设计单因素试验和正交试验，得出了提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度40%，超声波功率400W，超声波处理温度50℃，超声波处理时间50min，液料比25∶1（mL/g），硫酸铵用量8 g，回流提取时间3 h，回流提取温度60℃。通过平行试验的验证可知，该方法不但得率较高，而且试验重现性好，也说明正交试验得出的结论是正确的。同其他方法相比，超声波辅助双水相提取法具有操作简便，得率高，分离容易等优点。该研究结果对脐橙皮中黄酮的进一步开发利用提供了理论基础。

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Study on Extraction Technological of Flavonoid in Navel Orange Peel by Ultrasonic-assisted Aqueous Two-phase System

WANG Jian-hong1，2，KUANGChen1
（1.College ofChemistry and Chemical Engineering，Neijiang NormalUniversity，Neijiang 641112，Sichuan，China；2.Key Laboratory of FruitWaste Treatmentand Resource Recycling，Neijiang641112，Sichuan，China）

With low-temperature baked navel orange peel as raw materials，the flavonoid in navel orange peel was extracted by ultrasonic-assisted aqueous two-phase system of ethanol-（NH4）2SO4.The effectofethanol concentration，amountof ammonium sulfate，ultrasonic treatment temperature，ultrasonic treatment time，the liquid-solid ratio，reflux extracting temperature，and reflux extracting time，on the extraction rate of the flavonoid，were studied by the single factor experiments and the orthogonal tests.The result showed that the mostsuitable extracting conditionswere，the ethanol concentration of40%，the amountof the ammonium sulfate of8 g，the ultrasonic treatment temperature of50℃，the ultrasonic treatment time of 50min，the liquidsolid ratioof25∶1（mL/g），the reflux extracting temperatureof60℃，and the reflux extracting timeof3 h.Under the optimal conditions，four parallel experimentswere carried out，and the average extraction rate could reach 8.173%，whichwashighlymore than the yield by ultrasonic and no aqueous two-phase system，by aqueous two-phase system and no ultrasonic，and by no ultrasonic and no aqueous two-phase system at the same conditions.The reproducibilityof theexperimentswasgood.

navelorange peel；flavonoid；aqueous two-phase system；ultrasonic；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.013

2016-03-06

四川省教育厅重点项目（15ZA0291）；内江师范学院校级项目（14ZB01）

汪建红（1981—），男（汉），高级实验师，硕士，主要从事天然产物的提取、纯化及性质等方面的研究。