基于线粒体16S rRNA基因序列对3种珍珠贝的鉴定

刘国强, 刘 锐, 魏春雷, 张春华



基于线粒体16S rRNA基因序列对3种珍珠贝的鉴定

刘国强1, 刘 锐2, 魏春雷1, 张春华1

(1. 国家海洋局北海海洋环境监测中心站, 广西北海 536000; 2. 河北省邯郸市环境保护局, 河北邯郸 056002)

传统的形态鉴定主要依赖于分类者的经验和水平, 容易产生分类错误。为提高物种鉴定的准确性, 作者采用形态学与线粒体16S rRNA基因序列分析相结合的方式对广西北海涠洲岛采获的3种珍珠贝进行了鉴定。研究结果表明, 基于形态学可将3种珍珠贝分别鉴定为企鹅珍珠贝()、宽珍珠贝()和中国珍珠贝(), 但基于16S rRNA基因序列, 形态学鉴定为的标本应为.。和.是两个完全独立的种, 并非为同物异名。珍珠贝属16S rRNA基因序列的种间遗传距离明显大于种内遗传距离, 适宜作为该属种类鉴定的分子标记。在基于16S rRNA基因序列构建的系统树中, 相同种类的不同个体均形成单系群, 并获得很高的支持率。分布于中国沿海的珍珠贝属种类应包括, 是否有的分布尚需进一步证实。

珍珠贝属(); 16S rRNA基因; 种类鉴定

珍珠贝属()隶属珍珠贝目(Pterioida)、珍珠贝科(Pteriidae), 是一类具有重要经济价值的贝类, 中国沿海共分布有12种[1–2]。其中, 宽珍珠贝起初被王祯瑞[3]定为., 但随后又将.视为的同物异名[2], 此后国内许多学者[4–6]沿用了这一种名。而Tëmkin[7]认为.和为两个完全独立的种, 且能通过DNA序列加以区分。因此, 在中国分布的究竟是.还是, 或是两者兼而有之, 还未有相关研究的证实。

当前, 贝壳形态特征仍然是贝类分类的主要依据。然而, 贝壳形态会随环境变化产生差异, 许多种内变异很大或一些种间差异并不明显, 进而导致标本难以准确鉴定[8]。分子生物学技术不仅广泛应用于贝类的系统发育研究[7, 9-10], 在种类鉴定和区分上也具有重要应用价值[8, 10-12]。作者以采自广西涠洲岛海域的3种珍珠贝属种类为材料, 通过测定其线粒体16S rRNA基因序列对其进行鉴定, 并结合GenBank中下载的其他珍珠贝属种类序列分析了该属的系统发育关系, 以期为其他研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

作者所用的中国珍珠贝()、.和企鹅珍珠贝() (图1)采自广西涠洲岛海域, 样品数分别为2、1和3个。样品冷冻保存带回实验室后, 取其腹足肌保存于无水乙醇中, –20℃保存备用。

1.2 DNA提取和PCR扩增

采用CTAB法提取样品总DNA[13], 使用引物16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[14]扩增线粒体16S rRNA基因片段。

PCR反应体系总体积为50 μL, 其中:10×buffer 5 μL, dNTP 200 μmol/L, 引物各0.3 μmol/L, Taq酶1.5 U, 模板DNA 1 μL, 加去离子水补足至50 μL。PCR反应条件为:94℃预变性2 min; 94℃变性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35个循环; 最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化, 然后进行双向测序, 测序引物与扩增引物相同。

1.3 数据处理和系统树构建

采用Bioedit 7.0.1 软件进行序列拼接, 并辅以手工校对。合并从GenBank 下载的数据, 利用ClustalX1.8.3 软件对序列进行多重比对。采用MEGA 5.10分析序列的碱基组成以及基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter, K2P)的遗传距离, 并利用该软件中的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统进化树, 可靠性经过1 000次自展(bootstrap)检验。文中仅在系统树上标注出大于50%的自展支持率。

a–b. 中国珍珠贝; c–d..; e–f. 企鹅珍珠贝; 比例尺=1 cm

a–b.; c–d.; e–f.; scale bar 1 cm

2 结果

2.1 碱基组成

序列提交GenBank, 获得登录号KT205283- 205288。3种珍珠贝的序列长度为495 bp ~529 bp (不包括引物区)。连同GenBank下载的9条珍珠贝属序列一起分析碱基组成, 珍珠贝属16S rRNA基因的A、T、G、C平均比例分别为25.5%、28.6%、29.5%和16.4%, A+T的比例较高。

2.2 遗传距离

珍珠贝属16S rRNA基因种内的平均遗传距离为0~0.005(范围0~0.011), 种间的平均遗传距离为0.088~0.227, 种内与种间的遗传距离差异明显(表1)。和之间的种间遗传距离最小, 为0.008;和之间的种间遗传距离最大, 达0.227。作者测得的序列与GenBank中已有的序列(登录号HQ329435)完全相同。

表1 珍珠贝属种类的种内及种间平均遗传距离

注:“/”表示仅1个个体, 无遗传距离

2.3 系统学分析结果

以为外群, 基于16S rRNA基因序列构建了NJ树(图2), bootstrap支持率高于50%的标注在节点处。由图2可见, 所有相同种类的不同个体均形成单系, 并获得很高的支持率。珍珠贝属的种类在NJ树中明显可分为2个支系, 支系Ⅰ包括和, 支系Ⅱ包括、、、和, 但两个支系获得的支持率较低(<50%)。

黑体显示的序列号为本研究测得

Accession numbers in bold are sequenced in this study

3 讨论

海洋贝类是种类十分丰富的一大类群, 贝壳形态各异, 颜色丰富多彩, 鉴定难度较大。贝壳的壳形、壳色等是种类鉴定和区分的主要依据, 但这些特征会因为形态可塑性、趋同进化、性别以及生长发育阶段的不同而出现变化, 如蜘蛛螺属()成体和幼体贝壳的形态差异很大[15], 脉红螺()也会因栖息海区和底质环境等因素的不同导致形态变异较大[16]。

作者采集到的标本与国内其他学者[2–6]所描述的或在形态学上基本一致, 可以断定它们应属于同一个种。作者的标本在腹缘上具有较多的小棘刺, 这一特征在国内其他学者所描述的标本中并未见到。基于线粒体16S rRNA基因序列的分析结果表明, 国内记录到的种类应为而非, 中国沿海是否有的分布尚需进一步证实。珍珠贝属16S rRNA基因序列的种间遗传距离明显大于种内遗传距离, 适宜作为该属种类区分的标记。

形态鉴定是当前海洋生物多样性监测工作的主要手段, 监测数据的质量直接取决于鉴定者的水平和经验。而目前专业的分类人才极度匮乏, 已成为监测工作的短板。中国已连续多年开展海洋生态监控区的生物多样性监测工作, 取得了大量的数据, 但是仍然缺少完整的生物物种组成准确名录与分布记录, 不能满足多样性全面分析比较的需要[17]。不同鉴定者之间或是不同年份之间的数据可比性较差。传统的形态鉴定和分子生物学技术相结合, 会极大地提高物种鉴定的准确性, 提升生物多样性监测的水平。

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(本文编辑: 谭雪静)

Species identification of threespecies based on mitochondrial 16S rRNA gene

LIU Guo-qiang1, LIU Rui2, WEI Chun-lei1, ZHANG Chun-hua1

(1. Marine Environmental Monitoring Center of Beihai, State Oceanic Administration, Beihai 536000, China; 2. Handan Municipal Bureau of Environmental Protection, Handan 056002, China)

Species identification based on morphology highly relies on the ability of taxonomists. Some species can be easily misidentified based on morphological characteristics alone. To improve the accuracy of species identification, threespecies sampled from Weizhou Island, Guangxi, were identified based on shell morphology and mitochondrial 16S rRNA gene sequences. These three species were identified as,and, respectively, based on shell morphology. However, the specimen that was identified asbased on morphological characteristicswas later identified as.using 16S rRNA gene sequences.and.are two distinct species and are not synonyms. The genetic distances are much higher between species than within species, indicating that 16S rRNA gene is useful for species identification in the genus..is a valid species, andexists in China, with no further confirmation required.

; 16S rRNA gene; species identification

Jul. 9, 2015

Q959.212

A

1000-3096(2016)09-0018-05

10.11759//hykx20150709003

2015-07-09;

2015-12-03

国家自然科学基金项目(41306132)

刘国强(1979–), 男, 山东昌邑人, 硕士, 高级工程师, 主要从事海洋生物多样性监测与评价研究, E-mail: liuguoqiang0821@ 163.com

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41306132]