IL-23R的表达及基因多态性与脓毒症引起的急性肺损伤临床预后相关性

孟建斌，孙丽萍，瓦永禄，刘丽莉，姚 茜

(青海红十字医院重症医学科)



IL-23R的表达及基因多态性与脓毒症引起的急性肺损伤临床预后相关性

孟建斌，孙丽萍，瓦永禄，刘丽莉，姚 茜

(青海红十字医院重症医学科)

目的 研究IL-23R的表达及基因多态性与脓毒症引起的急性肺损伤临床预后相关性。方法 选取脓毒症引起的急性肺损伤病人与健康者对照，分别抽取外周血并提取总RNA和DNA，利用PCR技术测定IL-23R的mRNA值；利用PCR结合测序技术测定IL-23R不同位点基因多态性。结果 脓毒症引起的急性肺损伤病人IL-23R表达显著上调，并且对30天死亡率有较强的预后评估作用；IL-23R基因的rs10889677和rs1004819位点与30天死亡率显著相关。结论 IL-23R的表达及基因多态性与脓毒症引起的急性肺损伤预后密切相关。

IL-23R 基因多态性 脓毒症 急性肺损伤

目前国际上对脓毒症引起的ALI/ADRS病人预后评判的标准多用APACHE I-IV评分系统[1]。ICU的临床研究发现，相同分数的病人体现出的病理生理及治疗预后存在巨大差异[2]。以往人们习惯性地将其归因于环境因素，病人个体差异等。随着分子生物学技术的发展，科学家发现，这种差异和病人的基因多态性存在很大联系。基因多态性即在某随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上基因型，它可决定人体对疾病的易感性。所以，探索关键基因的基因多态性与脓毒症引起的ALI预后的关系，可为个体化用药治疗提供依据。目前，已报道与脓毒症引起的ALI相关的基因多态性包括TNF、IL-1、IL-10、HSP-70等[1-3]。

IL-23R属于促红细胞生成素受体超家族中的一员，是致炎因子IL-23的异二聚体受体中特异性组成成分。其基因位于人1号染色体上，编码区大小为150 kb左右。作为一种跨膜蛋白，它在人的T淋巴细胞、NK细胞、DC细胞和巨噬细胞的细胞膜上均有所表达。IL-23可与IL-23R结合，通过IL-23R介导的细胞内信号转导实现调控免疫应答的功能[4]。在脓毒症引起的ALI/ADRS疾病中，TH17细胞起着介导炎性反应的发生和发展的作用，从而造成肺脏的功能性损害。作为IL-23/TH17这一细胞轴通路的关键因素，IL-23R在脓毒症引起的ALI/ADRS患者的表达情况，单核苷酸基因多态性分布情况以及其在发病中是否起到与其功能相对应的作用，是一项值得探讨的课题。本项研究的目的是检测脓毒症引起的ALI/ADRS患者外周血白细胞中IL-23R的表达水平及单核苷酸基因多态性，并初步探讨其与患者治疗预后的相关性。

1 对象与方法

1.1 临床病例选择

脓毒症引起的ALI/ADRS病人均收自青海红十字医院ICU。脓毒症的定义及等级参考美国及欧洲胸科医师学会和新柏林的定义。共有45例重度脓毒症患者和113例普通脓毒症患者被纳入此项研究。该研究得到了青海红十字医院伦理委员会的批准，所有患者或其亲属代理人均签署了知情同意书。患者年龄、性别和BMI、APACHE II 评分等临床数据如表1 所示。

Table 1 Clinical characteristics of severe sepsis and sepsis-induced ALI and healthy ±s)

1.2 试剂选择

全血提取试剂盒购自QIAGEN公司；RNA提取试剂盒及PCR试剂购自TAKARA公司；IL-23R检测的ELISA试剂盒购自R&D公司；Trizol购自Invitrogen公司。

1.3 外周静脉血DNA提取

利用全基因组DNA提取试剂盒提取外周静脉血基因组，具体方法如下：采集4 mL外周静脉血于抗凝真空采血管中，置-20 ℃超低温冰箱中备用。取血液样本250 μL于1.5 mL的EP管中，加入细胞裂解液400 μL，颠倒混勾，离心(10，000r/min)1 min，除去上清液，剩细胞核沉淀，向离心后的细胞核沉淀中加入250 μL缓冲液1(出自全血基因组提取试剂盒)，震荡混匀后，加入25 μL蛋白酶K溶液，EP管置于56 ℃水浴锅(10min)，离心，加入缓冲液2(出自全血基因组提取试剂盒)以吸附柱离心方法收集DNA。DNA的浓度和纯度用紫外分光光度计检测，所提DNA置-20 ℃超低温冰箱中备用。

1.4 外周静脉血总RNA提取

每毫升全血加入1 mL Trizol，室温下沉淀、溶解后，按说明抽提总RNA，以DU 800分光光度计定量，以琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性，放入凝胶成像仪拍照，置-70 ℃超低温冰箱中备用。

1.5 RNA逆转录

根据浓度计算取500 μg相应体积的总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA。按下列组份在冰上配制10 μL反应体系的RT反应液：5×Prime Script Buffer 2 μL；Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL；Oligo dT Primer(50M)0.5 μL；Random 6 mers(100M)0.5 μL；ExScriptRTase(RNaseH free，200 U/l)0.25 μL；RNase Inhibitor(40U/l)；500 ng相应体积的总RNA；RNase Freed H2O 。逆转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5sec，4 ℃，反应结束后，样品放入-20 ℃超低温冰箱中备用。

1.6 实时定量PCR试验

IL-23R的引物为：上游引物5′CAA GAA ACA GGC AAA AGG TA 3′；下游引物5′ATG TGA CCT GGG GAA CTG T 3′。PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 2.5 μL；上游引物0.1 μL；下游引物0.1 μL；cDNA 1 μL，去离子水补齐至5 μL反应体系。PCR的反应扩增条件为：95 ℃ 15 s；(95℃ 15 s，60℃ 130 s)四十个循环，最后于72 ℃延伸5 min。输入384孔板中需采集的孔位及检测基因类别，每个标本均作3个复孔，计算时取平均值。每次PCR反应均设置无cDNA的样本作阴性对照，无cDNA无引物的空白SYBR master mix作空白对照。针对RNA产物，Sequence Detector 1.7软件分析其CT值，并计算RQ值以对其mRNA进行相对定量。针对DNA产物，通过胶回收后送往上海生工公司进行测序，分析单核苷酸位点基因的多态性。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 脓毒症引起的ALI/ADRS病人外周血中IL-23R的表达量显著升高

脓毒症患者、重度脓毒症患者和健康志愿者的临床特征如表1所示。脓毒症组男性62例，女性51例；重度脓毒症组男性23例，女性22例。本实验共招募健康志愿者男性12例，女性9例。年龄、性别、身体质量指数(BMI)等数据组间无显著差异。QRT-PCR结果显示，与健康对照组相比，重度脓毒症及脓毒症引起的ALI/ADRS患者外周血中IL-23R的表达量显著升高。

随访23例病情有所好转的病例，其中重度脓毒症引起的ALI患者10例，脓毒症引起的ALI患者13例。发现治疗后的患者IL-23R值显著低于发病初期时，这说明IL-23R 的表达在发病期达到峰值，而在恢复期趋于回调，提示IL-23R的动态变化与预后存在相关性。

Table 2 IL-23R expression alternation before and after treatment among 23 cases of sepsis-induced acute lung injury ±s)

2.2 IL-23R的表达与脓毒症引起的ALI/ADRS病人预后关系

为了研究IL-23R的表达与脓毒症引起的ALI/ADRS病人30天死亡率的关系，我们以患者是否死亡为标准绘制了ROC曲线。并利用AUC值(即ROC曲线下部面积)比较其与APACHE II打分的优劣。IL-6作为一种新近发现的诊断标志物，也可用于比较对照。我们发现IL-23R的AUC值为0.8[95% CI(0.717-0.883)]，这个值较APACHE II打分的AUC值略低0.814[95% CI 0.718-0.911)](P<0.05)，但比IL-6的AUC值[0.753(95% CI 0.663～0.843)]高(图1)，这说明IL-23R的表达可以作为判断治疗预后的标志物之一。

图1 IL-23R表达、APACHE II打分及IL-6表达对30天生存率的ROC曲线图

Figure 1 The ROC curve for IL-23R expression，APACHE II score，and IL-6 expression related to 30-day mortality

2.3 IL-23R基因多态性与脓毒症引起的ALI/ADRS病人预后关系

我们将患者分为死亡组及非死亡组，并比较其与IL-23R基因多态性的相关性。我们发现与死亡发生最相关的单核苷酸多态性为rs10889677位点；rs1004819位点的A发生频率在死亡组也显著高于对照组；其他位点并未发现显著的相关性(表3)。

表3 rs10889677和rs1004819位点单碱基及基因亚型分布比较(%)

Table 3 Allele and genotype distribution of rs10889677 and rs1004819(%)

3 讨论

利用血液中的标志物，辅助APACHE II打分，判断脓毒症引起的ALI/ADRS治疗预后，对提高该疾病的生存率和治愈率具有重要的意义。本研究发现IL-23R的表达及基因多态性与脓毒症引起的ALI/ADRS生存率存在密切的相关性。IL-23R髓系细胞，如单核细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞等低水平表达，其结构分为跨膜区和胞质区：细胞内的胞质区包含7个酪氨酸残基，这个区域已被证明可引起下游一系列的信号转导。IL-23R可与JAK2相互作用，导致下游的STAT信号家族及JAK2、TYK2的激活。 这其中最重要的信号通路为STAT3通路，被激活的STAT3可诱导记忆性T细胞分化为Th17细胞，并促进其分泌IL-17，从而引发下游一系列相关免疫应答及免疫紊乱。由此可见，IL-23R是Th17细胞亚群关键的调控作用因子。目前，IL-23R的免疫调控作用已经在多种自身免疫病中得到证实，例如Cua等人发现自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠体内的IL-23R对发病起着重要的调控作用。某些临床研究发现IL-23R单克隆抗体可以有效治疗自身免疫性疾病，提出通过阻断IL-23R介导的下游免疫信号通路可提高免疫病疗效的新机制。

鉴于脓毒症引起的ALI/ADRS的发病机制和预后均与机体免疫应答存在极大的关联性，我们推测在这些患者中也存在着IL-23R/Th17轴的异常。本实验的结果提示，脓毒症引起的ALI/ADRS患者组的IL-23R的mRNA表达明显高于对照组，差异有统计学意义，提示在脓毒症引起的ALI/ADRS者外周血中可能存在着IL23R-Th17细胞轴的异常。

IL-23R基因多态性也被报道与自身免疫性疾病有明显联系，为了进一步证实IL-23R与脓毒症引起的ALI/ADRS的相关性，我们检测了部分IL-23R的SNP基因多态性，发现rs10889677和rs1004819与患者的生存率显著相关。Rs10889677位于IL-23R的3′非编码区域，被证明可提高其mRNA的表达，并改变microRNA的调控能力。同时，rs10889677突变，可调控T细胞向Th17的分化，影响IL-17等细胞因子的表达。Rs1004819位于IL-23R基因的内含子部分，可调控IL-23R的mRNA表达含量。以上结果也证实，IL-23R在脓毒症引起的ALI/ADRS发病过程中起着重要的调控作用，其基因多态性和表达含量，是判断病情发展和预后的重要指标。

[1]Zhang Z，Chen K，Chen L.APACHE III Outcome Prediction in Patients Admitted to the Intensive Care Unit withSepsis Associated Acute Lung Injury.Plos One，2015，30，e0139374.

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IL-23R expression and genetic polymorphisms and their relationship with sepsis-induced acute lung injury

Meng Jianbin，Sun Liping，Wa Yonglu，Liu Lili，Yao Qian

(Department of Critical Care Medicine，Qinghai Red Cross Hospital)

Objective To study the association of interleukin-23 receptor(IL-23R)expression and genetic polymorphisms with sepsis-induced acute lung injury(ALI).Methods 45 cases of patients with severe sepsis and 113 cases of general sepsis caused ALI and 21 cases of healthy volunteers were enrolled in this study.Plasma IL-23R mRNA were determined by qRT-PCR.Genotyping analysis of IL-23R was performed using PCR-followed sequencing.Results The relative plasma IL-23R concentrations were significantly increased in severe sepsis and sepsis-induced ALI，compared with control subjects，and the expressions were highly related with the 30-day mortality rate.rs10889677 and rs1004819 genetic Polymorphisms were associated with the 30-day mortality rate.Conclusion There is close association between IL-23R expression and genetic polymorphisms and the prognosis of sepsis-induced acute lung injury.

IL-23R Genetic Polymorphisms Sepsis Acute Lung Injury

R392

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.010

2015-12-13

孟建斌(1972～)，男，汉族，河南籍，副主任医师