继发性红细胞增多症对COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核红细胞凋亡及Bcl-2表达的影响※

齐亚丽，解友邦，顾玉海

(青海省人民医院，青海 西宁 810007)



继发性红细胞增多症对COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核红细胞凋亡及Bcl-2表达的影响※

齐亚丽，解友邦，顾玉海*

(青海省人民医院，青海 西宁 810007)

目的 探讨继发性红细胞增多症(SP)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)男性患者呼吸功能和骨髓有核红细胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影响。方法 分别选取30名单纯骨折男性患者和32名COPD男性患者、21名COPD+SP男性患者作为对照组和COPD组、COPD+SP组。用肺功能仪等仪器评价患者呼吸功能。用流式细胞仪测定骨髓有核红细胞凋亡率、RT-PCR 法检测Bcl-2 mRNA 的表达水平。结果 COPD+SP组肺功能(FEV1/FVC%)低于COPD组，而mMRC呼吸困难评价分级评分大于COPD组(P<0.05)；COPD+SP组骨髓有核红细胞凋亡率明显低于对照组和COPD组(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表达明显高于对照组和COPD组(P<0.05)。结论 SP影响COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困难的程度。Bcl-2家族分子可能参与了COPD+SP男性患者骨髓有核红细胞凋亡异常的机制。

慢性阻塞性肺疾病 继续性发红细胞增多症 骨髓有核红细胞 细胞凋亡 Bcl-2

目前关于慢性阻塞性肺疾病合并继发性红细胞增多症的临床研究文献有一些报道[1-2]，但关于继发性红细胞增多症(SP)影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)骨髓红系细胞凋亡和抗凋亡的研究未见报道。本研究探讨了SP对COPD患者呼吸功能和骨髓有核红细胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影响，为临床合理治疗慢性阻塞性肺疾病合并继发性红细胞增多症提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择

患者共分为对照组和COPD组、COPD+SP组。对照组为30例男性单纯骨折患者，年龄36.9±16.9岁，通过入院常规检查排除其他疾病。COPD组为32例男性患者，年龄43.3±15.4岁，结合病史严格按照COPD指南进行症状、体征、肺功能及其他相关辅助检查。COPD+SP组为21例男性患者，年龄39.5±14.9岁，结合病史严格按照COPD指南和SP诊断标准进行症状、体征、肺功能及其他相关辅助检查，并采用AS-PCR法检测骨髓细胞JAK-2V617F突变情况，要求均为阴性，以排除真性红细胞增多症。研究经青海省人民医院医学伦理委员会审核通过，并取得研究对象知情同意。

1.2 呼吸功能评价

采用FEV1/FVC%、CAT(COPD assessment test，CAT)评分、mMRC(breathlessness measurement using the modified British Medical Reseach Council，mMRC)呼吸困难分级评分等评价患者呼吸功能。

1.3 血红蛋白、红细胞和红细胞压积测定

采用全自动生化分析仪测定患者血红蛋白、红细胞和红细胞压积。

1.4 有核红细胞凋亡检测

采用密度梯度法分离骨髓单个核细胞、免疫磁珠法分离单个核细胞中的有核红细胞(CD71)；流式细胞仪法检测骨髓有核红细胞细胞凋亡。严格按凋亡试剂盒(美国BD公司) 说明书操作。用流式细胞仪自带软件分析结果。

1.5 Bcl-2 mRNA表达测定

用Trizol试剂提取总RNA并定量，取适量RNA用AMV反转录酶制备cDNA。用荧光定量PCR仪进行PCR反应，反应参数：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 60 s退火，共40个循环。每次扩增设置β-actin基因内参照。用PCR仪自带软件进行荧光定量分析，得出Ct值。引物和TagMan荧光探针由Primer Express软件设计，上海生工生物工程有限公司合成。

Bcl-2引物序列：

5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′(上游引物)

5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′(下游引物)

GAPDH引物序列：

5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(上游引物)

5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′(下游引物)

1.6 数据统计分析

2 结果

2.1 血红蛋白、红细胞和红细胞压积

对照组和COPD组、COPD+SP组的血红蛋白和红细胞、红细胞压积测定结果见表1。表1显示，与对照组比较，COPD+SP组的血红蛋白和红细胞、红细胞压积分别显著升高69.93%和49.44%、23.20%。与COPD组比较，COPD+SP组的血红蛋白、红细胞和红细胞压积分别显著升高61.07%、37.27%和11.47%。

2.2 呼吸功能评价结果

COPD组和COPD+SP组的肺功能比值(FEV1/FVC%)、CAT评分、mMRC呼吸困难评价分级评分结果见表2。表2显示，COPD+SP组肺功能比值(FEV1/FVC%)低于COPD组，而mMRC呼吸困难评价分级评分大于COPD组。

Table 1 Comparison of the levels of Hb，RBC and HCT in Control，COPD and COPD+SP ±s)

a：与对照组比较，P<0.05；b：与COPD组比较，P<0.05.

组别例数FEV1/FVC(%)CAT评分mMRC呼吸困难分级(分)COPD组3275．36±5．643．86±1．284．52±1．26COPD+SP组2164．86±7．253．92±0．945．32±0．87

2.3 骨髓有核红细胞凋亡率和Bcl-2 mRNA 表达水平

对照组和COPD组、COPD+SP组的骨髓有核红细胞凋亡情况见表3和图1，Bcl-2 mRNA表达见表3。表3、图1显示，COPD+SP组骨髓有核红细胞凋亡率明显低于对照组和COPD组(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表达明显高于对照组和COPD组。

组别例数骨髓有核红细胞凋亡率(%)Bcl-2mRNA对照组304．62±1．205．92±1．16COPD组324．53±1．216．21±2．70COPD+SP组211．32±0．66※#10．15±2．92※#

a：与对照组比较，P<0.05；b：与COPD组比较，P<0.05.

2.4 骨髓有核红细胞凋亡率和Bcl-2 mRNA表达量及与Hb浓度的相关性

和Bcl-2 mRNA表达量及Hb浓度的相关性分析结果见图2。图2显示，Bcl-2 mRNA表达量和骨髓有核红细胞凋亡率呈负相关，而凋亡率和血红蛋白浓度呈负相关。

图1 骨髓有核红细胞凋亡指数流式图(1：对照组；2：COPD组；3：COPD+SP组)

Figure 1 Apoptosis chart of bone marrow nucleated cells detected by flow cytometry(1：Control group；2：COPD group；3：COPD+SP group)

3 讨论

本研究显示，SP影响COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困难的程度。Bcl-2家族分子可能参与了COPD+SP男性患者骨髓有核红细胞凋亡异常的机制。

SP主要有真性、继发性、相对性和应激性红细胞增多症。SP又分新生儿红细胞增多症、高原性红细胞增多症以及慢性肺疾病、心血管疾病等继发性红细胞增多症。慢性阻塞性肺疾病继发红细胞增多可导致脾大、高血压、血栓等，这些并发症对患者造成了严重威胁[3]。目前关于继发性红细胞增多对肺功能及呼吸困难程度的影响未见报道，但有学者在临床治疗中发现灯盏花素治疗AECOPD可明显改善患者的肺功能，降低血液粘稠度，纠正高凝状态，改善微循环，增加血氧饱和度和改善肺功能[4]，COPD是引起脑梗死的高危因素，这可能与慢性阻塞性肺病患者长期慢性缺氧，二氧化碳潴留，D-二聚体，血红蛋白及纤维蛋白原升高有关[5]。

本研究发现COPD合并继发性红细胞增多症后，肺功能降低明显，可能与红细胞的过度累计导致血液粘度增大，进而影响气血交换有关。高原红细胞增多症患者血粘度和红细胞压积相比高原健康人群显著升高，由于环境缺氧，血液中红细胞数代偿性增加，使红细胞压积升高，血红蛋白增加，引起血粘度升高，使红细胞的变形性下降，引起全血粘度升高[6]，但目前关于血液粘度对肺功能的影响国内未见报道，但很多文献报道COPD患者通过活血化瘀或抗凝治疗改善患者肺功能的同时减轻呼吸困难的程度。

慢性高原病红细胞增多的机制研究发现，在骨髓有核红细胞增多的基础上伴有红细胞凋亡的降低[7，8]，但是关于COPD合并继发性红细胞增多的骨髓有核红细胞凋亡机制的研究较少。有报道称，继发性红细胞增多症患者血清P53蛋白和Bcl-2蛋白水平增加，并且均与Hb浓度呈显著正相关，提示P53蛋白和Bcl-2蛋白可能与继发红细胞增多的发生发展有关[10]。

我们的研究结果证实，继发性红细胞增多症患者骨髓有核红细胞凋亡指数下降，抗凋亡相关基因表达增加，提示慢性阻塞性肺疾病继发性红细胞增多症可能是促红细胞生成素增加导致红细胞异常增生和抗凋亡减少，并导致过度积累的双重作用结果。

骨髓红系细胞通过与造血微环境的相互作用维持机体内红细胞的稳态。其过程复杂，涉及红系细胞外的调节因子、细胞内的遗传学和表观遗传学调控等多个环节[11]。缺氧是引起红细胞增多的主要原因，主要有EPO介导的红细胞增殖学说，低氧诱导因子1通过与促红细胞生成素(EPO)的启动子结合，提高EPO-mRNA活性，致EPO的分泌增加。但在HAPC患者中EPO水平不总是和红细胞增生的数量相一致。其他可能性因素包括遗传适应性、对EPO的反应性、造血生长因子、转录因子及造血系统微环境的调控等[12]。但红细胞的数量的衡定是在骨髓红细胞生成和外周凋亡之间保持平衡的结果，在骨髓红系统分化调控的同时伴随细胞凋亡的参与。在细胞凋亡的过程中，线粒体起着关键性的作用，细胞线粒体通透性的改变可以诱发细胞凋亡，Bcl-2 家族蛋白参与线粒体的这种通透性的改变[13，14]。线粒体膜的通透性受Bc1-2家族蛋白成员精确的调控，线粒体通透性转变孔道可由Bc1-2家族蛋白诱导开放。缺氧诱导Bcl-2 表达，从而抑制线粒体释放细胞色素C，降低caspase-3 的活性，抑制细胞凋亡[15]。

本研究发现，在COPD合并继发性红细胞增多的患者中，Bcl-2mRNA表达增高，提示抗凋亡因素也参与在心肺疾病导致红细胞增多的过程。

心肺疾患导致的继发红细胞增多是红细胞过度生成和凋亡减少共同作用的结果，COPD继发红细胞增多的细胞凋亡机制与其他疾病的凋亡有着相同或相似的信号传导通路，它是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。本研究初步探讨了继发性红细胞增多症对慢性阻塞性肺疾病患者呼吸功能和骨髓有核红细胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影响，详细机理还有待进一步研究。

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Influence of Secondary polycythemia on respiratory function，apoptosis of bone marrow nucleated red blood cells and Bcl-2 mRNA in patients with COPD

Qi Yali，Xie Youbang，Gu Yuhai

(Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining，Qinghai 810007)

Objective The aim of the study was to investigate the impact of secondary polycythemia(SP)on respiratory function，bone marrow nucleated red blood cells apoptosis and Bcl-2 mRNA expression in male patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods To select 30 male simple fracture patients as control group，32 male COPD patients and 21 male COPD complicated with SP patients as COPD group and COPD+SP group.Pulmonary function(FEV1/FVC)of patients were evaluated using the spirometer.The apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells were measured by flow cytometry.Expression levels of Bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR.Results Respiratory function(FEV1/FVC)of COPD+SP group were lower than COPD group and the mMRC score were greater than that of COPD group(P<0.05).Apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells with COPD+SP were significantly lower than that of the control group and COPD group.The expression levels of Bcl-2 mRNA were significantly higher than that of the control group and COPD group(P<0.05).Conclusions SP can affect the male respiratory function(FEV1/FVC)and increase the degree of dyspnea in COPD patients.Bcl-2 family molecules may be involved in abnormal apoptosis of marrow nucleated red blood cells in male patients with COPD complicated with SP.

COPD Secondary polycythemia Bone marrow nucleated red blood cells Cells apoptosis Bcl-2

R555

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.002

2016-01-09

※：青海省重点学科项目(呼吸科)(青财社字[2013]2578号)资助.*：通讯作者，主任医师，Email：qhguyuhai@163.com 齐亚丽(1978～)，女，汉族，甘肃籍，硕士，主治医师