铅对人Bel-7402肝癌细胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影响

吴家兵，杨永坚，王先良，叶丹，杨文静，钱岩，吕占禄，郭辰，梁豹，赵淑莉

1. 安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系，合肥 230032 2. 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012 3. 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100050 4. 中国环境监测总站，北京 100029



铅对人Bel-7402肝癌细胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影响

吴家兵1,2，杨永坚1,*，王先良2,3,#，叶丹3，杨文静3，钱岩2，吕占禄2，郭辰2，梁豹1,2，赵淑莉4

1. 安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系，合肥 230032 2. 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012 3. 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100050 4. 中国环境监测总站，北京 100029

以体外培养人Bel-7402肝癌细胞为模型，研究铅的3种常见化合物氯化铅(PbCl2)、乙酸铅(Pb(CH3COO)2)、硝酸铅(Pb(NO3)2)的细胞毒性和去甲基化表观遗传毒性。应用MTS方法检测细胞的存活率，以前期研究建立的评价方法评价铅化合物的去甲基化表观遗传毒性。结果显示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均会抑制Bel-7402细胞的增值，计算求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2相应的50%细胞存活浓度(IC50)值分别为2 524 μmol·L-1、1 977 μmol·L-1、1 899 μmol·L-1；80%细胞存活浓度(IC80)值分别为264 μmol·L-1、221 μmol·L-1、281 μmol·L-1，通过对3种染毒物不同染毒浓度的细胞存活率进行随机区组设计的方差分析显示3种化合物间的差异无统计学意义(F= 0.11；P= 0.897)。去甲基化表观遗传毒性检测结果显示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均可观察到明显的去甲基化表观遗传毒性，其相对于5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)的去甲基化表观遗传毒性当量分别为2.82E-03、1.50E-03、5.09E-04，三者间也无显著性差异。结果表明，铅化合物会使Bel-7402细胞的细胞存活率和转染进细胞的质粒上增强型绿色荧光蛋白基因启动子的DNA甲基化水平下降。

铅；Bel-7402细胞；去甲基化；MTS

Received 23 September 2015 accepted 28 October 2015

环境化合物引起的健康损害与表观遗传损伤关系密切，表观遗传毒性是化学品安全性评价的新问题[1]。研究发现许多通过现有安全性评价检测的化合物，没有发现存在基因突变、染色体畸变等遗传学损伤能力，却依然可以通过表观遗传学机制对人类产生深远影响[2]。而铅作为环境中普遍存在的有毒重金属，可造成人体多种组织和器官的损害，低剂量接触就可引起各种亚临床改变如阿尔兹海默病[3]、精神发育迟滞等[4]。有研究显示我国儿童铅暴露所致精神发育迟滞的发病率远高于西太平洋地区的平均水平[5]。因此，评价铅及其化合物的表观遗传毒性是其安全性评价面临的新问题。近年来，随着检测技术的发展，国内外学者对铅暴露诱发的表观遗传学改变，特别是致DNA甲基化异常的研究取得了一些进展，但对其致基因组DNA甲基化改变大小的定量评价还未见报道[6]。而不管是体内实验还是体外实验，了解环境化学物对于人类甲基化水平的作用能力大小，对丰富化学物的潜在毒性评价信息以及安全性评价体系的建立和标准的制定均有重要的参考价值。有专家已经开始认识到定量检测环境化合物去甲基化表观遗传毒性的重要性[7-8]。

本研究中我们选择了3种铅的常见化合物乙酸铅、硝酸铅、氯化铅为研究对象，以体外培养人Bel-7402肝癌细胞为模型。分别应用MTS方法检测细胞的存活率和通过前期研究建立的化学物去甲基化表观遗传毒性评价方法(简称QDMP)[9-12]检测其去甲基化表观遗传毒性，去甲基化表观遗传毒性评价结果以去甲基化药物5-Aza-CdR的浓度当量表示。该方法是将pEGFP-C3质粒通过人工甲基化处理，获得绿色荧光蛋白基因启动子区处于高甲基化状态的C3质粒，并将其转染进人类Bel-7402肝癌细胞株，随后以该细胞株为载体，与染毒液进行共培养，依据细胞绿色荧光强度来定量评价去甲基化功能的强弱，是对污染物表观遗传毒性评价技术的新探索。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

主要仪器：BIO-PRINT008型凝胶成像系统(Vilberlo urmat，法国)；高速离心机(Sigma 3K30 centrifuge，Sigma，美国)；流式细胞仪(Bechman Coulter Altra，美国)；水套式CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；生物安全柜(Thermo，美国)；Model680酶联免疫检测仪(Bio-RAD，美国)；IX71型荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；

主要试剂：Bel-7402细胞株和大肠杆菌DH5α感受态细胞由北京工业大学提供；Plasid maxi kit试剂盒(QIAGEN，美国)；DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Sigma，美国)；p-EGFP-C3质粒(Sigma，美国)；乙酸铅、硝酸铅、氯化铅(分析纯，中国西亚试剂公司)；DNA甲基化酶M.SssI、HpaII酶、MspI酶(New England Biolabs公司，美国)；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，美国)；500～7 500 bp DNA Marker(北京天根公司)。

1.2 铅化合物的细胞毒性检测

1.2.1 MTS实验

获取处于对数生长期生长良好的Bel-7402细胞，以每孔2×104个细胞接种于96孔板，每孔100 μL进行细胞铺板培养。移入细胞培养箱中以37 ℃、5% CO2条件培养，待细胞汇合度达80%～90%时进行细胞染毒。将已配好的终浓度染毒溶液临用前超声5 min，用无血清培养基配制所需各浓度的染毒液于1 mL EP管中(根据预实验和相关文献[13-15]将染毒浓度定为0、50、100、200、400 μmol·L-1)，弃去培养板中原培养液，以100 μL每孔加入已配好的各浓度染毒液，每个染毒浓度设6个平行样，染毒培养24 h。细胞染毒结束前1 h以20 μL每孔加入MTS，而后用锡箔纸包好置于细胞培养箱内，继续培养1 h后用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测吸光度。

1.2.2 数据分析处理

对各染毒化合物进行MTS实验后，计算细胞存活率(细胞存活率=(OD实验组-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100%)。而后参考赵斌等[16]和王姗姗等[17]提到的方法，应用SPSS软件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的半数抑制浓度IC50和80%抑制浓度IC80。

1.3 铅化合物的去甲基化能力检测

1.3.1 高甲基化pEGFP-C3质粒的获取

(1) pEGFP-C3质粒的扩增：参照江艳等[18]使用的方法对质粒进行扩增。(2) pEGFP-C3质粒的提取：依据Plasid maxi kit试剂盒(QIAGEN)的操作说明对扩增好的质粒进行提取。(3) pEGFP-C3质粒的甲基化修饰及纯化：参照甲基化酶M.SssI说明书(New England Biolabs)对提取好的质粒进行甲基化修饰处理，并用HpaⅡ酶切检测甲基化修饰处理效果，未甲基化DNA双链的去除和甲基化DNA的纯化按照Wang等[19]和MicroElute DNA Clean-Up Kit试剂盒(OMEGA)的操作说明进行。最后用微量分光光度计测定C3质粒的浓度，-20 ℃冷藏备用。1.3.2 高甲基化的pEGFP-C3质粒转染Bel-7402细胞株

Bel-7402细胞传代培养后，转入24孔培养板培养(铺板密度为每毫升2.0×105个细胞)，每孔加500 μL含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养，待细胞汇合度达80%～90%时，根据X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂盒说明书(Roche)，Fugene HD和甲基化C3质粒以3:1比例配制转染试剂混合物。每孔加入相应转染试剂混合物50 μL，转染6 h。

1.3.3 以经高甲基化pEGFP-C3质粒转染的Bel-7402细胞株为受试对象进行染毒

细胞转染6 h后进行染毒。根据MTS实验的结果确定各化合物的染毒浓度为3.125、12.5、50、200 μmol·L-1，每个浓度设3个平行孔。同时每组实验中均要以5-Aza-CdR为阳性受试物进行细胞梯度剂量共培养染毒处理，用以绘制标准曲线，通过前期实验[10]确定5-Aza-CdR的染毒浓度为 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1，每个浓度同样设3个平行孔。细胞染毒时间均为24 h。

1.3.4 细胞染毒后的荧光差异检测

胰酶消化细胞，离心弃掉上清液后用冷的PBS重悬细胞2次，经300目筛网过滤后移至流式管，用CELL Quest软件进行流式细胞术检测分析。

1.3.5 基于5-Aza-CdR染毒标准曲线的制作

对染毒浓度为0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1的5-AZA-CdR进行流式荧光检测，获得各浓度的荧光阳性细胞比例，再求出各浓度相对于空白对照孔增加的荧光阳性细胞比例，以所得值为纵坐标、相应染毒浓度为横坐标绘制标准曲线。以相同方法获得各重金属化合物相对于空白染毒孔增加的荧光阳性细胞比例，将此值作为y值代入标准曲线方程中求出相应的x，以此x除以其对应的重金属化合物浓度所得值即为各重金属化合物相应浓度去甲基化能力相对于5-AZA-CdR的当量值。最后计算它们的几何均数，所得结果即是各重金属化合物去甲基化能力相对于5-AZA-CdR的当量值。

1.4 分析方法

数据采用SPSS for windows 10.0进行均数检验、相关分析、回归分析等统计处理，曲线拟合采用Excel软件。

图1 C3质粒甲基化处理效果检测注：1，阴性对照；2，未甲基化处理质粒MspΙ酶切；3，未甲基化处理质粒HpaⅡ酶切；4，甲基化处理质粒MspΙ酶切；5，甲基化处理质粒HpaⅡ酶切；6，DNA Marker。Fig. 1 Methylation effects for C3 plasmidNote: 1. negative control; 2. unmethylation control; 3. unmethylation control; 4. methylated plasmid of enzyme by MspΙ; 5. methylated plasmid of enzyme by HpaⅡ; 6. DNA marker.

2 结果(Results)

2.1 pEGFP-C3质粒甲基化处理效果

由图1可见，未甲基化处理的质粒分别经HpaII和MspI酶切后电泳呈现涂抹现象，甲基化处理的质粒经MspI酶切后电泳呈涂抹现象，而经HpaⅡ酶切后与未经酶切的DNA一样均呈单一条带，提示经甲基化处理的质粒处于甲基化状态。HpaII和MspI酶切效果比对甲基化处理完全。提示经甲基化处理的质粒处于甲基化状态。

2.2 细胞毒性实验结果

根据前面提到的方法分别计算出各化合物各染毒浓度的细胞存活率后发现，随着染毒浓度的增加，Bel-7402细胞的细胞存活率均呈现下降的趋势，并与染毒浓度间有良好的线性关系，表明铅的这3种化合物均会抑制Bel-7402细胞的增值。应用SPSS软件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的IC50值分别为2 524、1 977、1 899 μmol·L-1，IC80值分别为264、221、281 μmol·L-1。通过对3种染毒物不同染毒浓度的细胞存活率进行随机区组设计的方差分析显示3种化合物间的差异无统计学意义(F= 0.11；P= 0.897)，详细结果见图2。根据本实验结果，为保证具有适当的细胞存活率，选择细胞存活率在80%以上的浓度作为各个铅化合物的染毒剂量，分别是3.125、12.5、50、200 μmol·L-1。

图2 铅的3种化合物PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2对Bel-7402细胞存活率的影响Fig. 2 Changes in cell viability in Bel-7402 cells after exposure to lead compounds PbCl2，Pb(CH3COO)2，Pb(NO3)2

图3 代表性5-Aza-CdR流式细胞绿色荧光检测图注：从左到右各图的5-Aza-CdR浓度分别为0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1。Fig. 3 Representative radiograph of detection effect on green fluorescence of flow cytometryNote: The exposure dose of 5-Aza-CdR from left to right were 0, 0.00016, 0.0008, 0.004, 0.02, 0.1 μmol·L-1.

2.3 各染毒化合物的去甲基化情况

2.3.1 5-Aza-CdR染毒标准曲线制作

依据上述方案用CELL Quest软件，以DNA荧光宽度为横坐标，GFP荧光阳性率为纵坐标(拟定对照组80%百分位数的GFP强度为GFP表达阳性基准)，进行流式细胞术检测分析(检查通道为FL1，设置为log)。得出2组甲基化能力测试5-Aza-CdR染毒标准曲线方程分别为y= 0.279ln(x) +4.764和y= 0.314ln(x) +9.285，其代表性5-Aza-CdR流式细胞绿色荧光检测图及相应标准曲线如图3及图4所示。结果显示，5-Aza-CdR各染毒组的荧光阳性细胞比例均高于空白对照组，且随着染毒浓度的上升，各组的荧光阳性细胞比例也随之上升，呈现良好的对数线性关系。

图4 代表性5-Aza-CdR流式细胞绿色荧光检测标准曲线Fig. 4 Representative graph of 5-Aza-CdR exposure standard curve for detection by green fluorescence of flow cytometry

2.3.2 铅化合物的表观遗传毒性检测结果

通过检测后发现，在荧光阳性细胞比例方面，PbCl2、Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2的各染毒浓度组荧光阳性细胞比例均高于空白对照组，但各染毒浓度组间的比较显示均无显著性差异，表明铅的这3种化合物在所研究的浓度范围内均具有去甲基化表观遗传毒性。在相对于5-Aza-CdR的去甲基化当量方面，如表1所示，在(3.125～200) μmol·L-1的染毒浓度范围内，Pb(CH3COO)2的去甲基化表观遗传毒性当量介于8.15E-05～4.85E-03的5-Aza-CdR之间；Pb(NO3)2去甲基化表观遗传毒性当量介于7.08E-05～2.84E-02的5-Aza-CdR之间；PbCl2去甲基化表观遗传毒性当量介于2.17E-04～2.15E-01的5-Aza-CdR之间。这3种染毒物去甲基化当量几何均值从小到大依次为PbCl2> Pb(NO3)2> Pb(CH3COO)2。通过对这3种染毒物的去甲基化表观遗传毒性当量值进行方差分析后显示，F= 0.855，P= 0.457。表明铅的3种化合物相对于5-Aza-CdR的去甲基化当量之间的差异没有显著性。

3 讨论(Discussion)

开展环境污染物的毒性效应综合评价是未来环境污染管理不可避免的关键科学问题，到目前为止，已经开展的健康危害评价涵盖急性毒性评价和慢性毒性评价等方面。而以去甲基化能力为代表的表观遗传毒性则并没有得到足够重视，但这种新型的表观遗传毒性在环境中更为广泛，比“三致”毒性更容易出现[20]。因此，评价环境化合物的去甲基化能力是化学品安全性评价面临的新问题，有专家已经开始认识到定量检测去甲基化表观遗传毒性的重要性[7-8]。

表1 各化合物相对于5-Aza-CdR的去甲基化当量情况

Table 1 Toxic equivalent quantity of each compounds (based on 5-Aza-CdR demethylation)

注：Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2组所对应的5-Aza-CdR标准方程为y = 0.279ln(x) +4.764，R2=0.946；PbCl2组对应的标准方程为y = 0.314ln(x) +9.285，R2= 0.883。

Note:The corresponding 5-Aza-CdR standard equation of Pb(NO3)2and Pb(CH3COO)2are “y = 0.279ln(x) +4.764, R2=0.946”; the corresponding 5-Aza-CdR standard equation of PbCl2is “y = 0.314ln(x) +9.285, R2= 0.883”.

铅是一种在细胞内不能被代谢转化降解的有毒重金属，但其可与DNA形成加合物，从而对细胞产生影响。在细胞研究方面，徐进等[21]发现铅能导致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤，包括细胞凋亡率和坏死率的增加；王秋菊等[15]发现铅可致C2C12成肌细胞发生凋亡损伤；还有研究显示铅暴露会抑制神经细胞SH-SY5Y的增值[22]。本研究应用体外培养Bel-7402细胞从DNA甲基化改变和凋亡损伤的角度阐释了铅对癌细胞的损害作用。通过比较发现，在相同染毒浓度时，Bel-7402肝癌细胞的细胞存活率均高于上述几种非癌细胞。

近年来，随着DNA甲基化检测技术的持续发展和不断完善，越来越多的体外细胞试验、动物试验及人群流行病学研究表明，铅暴露会改变基因组DNA和某些基因启动子区胞嘧啶的甲基化水平[6]。本次实验以人Bel-7402肝癌细胞为载体，通过以5-Aza-CdR为参照标准，获得了铅的这3种化合物相对于5-Aza-CdR的去甲基化能力当量值，实验中经过铅化合物染毒后，染毒组的荧光阳性细胞比例均低于空白对照组，表明铅暴露可使重组Bel-7402细胞中质粒上EGFP基因启动子的甲基化水平降低，显示其去甲基化表观遗传毒性。但与浓度间并无良好的线性关系，这与王丽君[22]和Rossiello等[23]的细胞研究结果类似。而通过对它们的细胞抑制率和去甲基化能力当量值的比较发现，各化合物间并无显著性差异，提示铅的各化合物对细胞增殖的影响和去甲基化能力大小可能并不随其阴离子类型的变化而产生显著性的改变。

研究进一步丰富了人们对铅化合物毒性的认识，对安全性评价体系的建立和标准的制定也有重要的参考价值。但本实验中仅对单一铅化合物的细胞毒性及表观遗传改变进行了研究，而环境中的污染状况多以多种污染物并存的复合污染为主，所以探究多种污染物并存的复合表观遗传毒性还有待我们进一步研究。

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Lead Toxicity to Human Liver Cancer Cells Bel-7402 and Their Effect on DNA Methylation Levels at Promoter Region of EGFP Gene

Wu Jiabing1,2, Yang Yongjian1,*, Wang Xianliang2,3,#, Ye Dan3, Yang Wenjing3, Qian Yan2, Lv Zhanlu2, Guo Chen2, Liang Bao1,2, Zhao Shuli4

1. School of Public Health, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China3. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 4. China National Environmental Monitoring Center, Beijing 100029, China

Human liver cancer Bel-7402 cells were used to estimate the cell toxicity and demethylation toxicity of 3 lead compounds including lead chloride (PbCl2), lead acetate (Pb(CH3COO)2) and lead nitrate (Pb(NO3)2). Cell viability was estimated firstly by MTS assay, and the demethylation toxicity of lead compounds was quantified by the method established and reported in earlier study. The results showed PbCl2, Pb(CH3COO)2and Pb(NO3)2all significantly inhibited the Bel-7402 cell proliferation and the IC50values were 2 524 μmol·L-1, 1 977 μmol·L-1, 2 524 μmol·L-1; the IC80values were 264 μmol·L-1, 221 μmol·L-1, 281 μmol·L-1. There was no significant difference of cell viability among 3 cell groups treated with different lead compounds (F= 0.11; P= 0.897). However significant epigenetic demethylation toxicity was observed for 3 compounds and their demethylation toxicity equivalency was 2.82E-03, 1.50E-03 and 5.09E-04 folds of 5-AZA-CdR, respectively. No significant difference was observed among their demethylation toxicity equivalency. The study revealed that lead compounds can inhibit Bel-7402 cell proliferation and induce obvious demethylation effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene.

lead; Bel-7402 cells; demethylation; MTS

10.7524/AJE.1673-5897.20150923001

国家环保公益性行业科研专项(201309045)；国家自然科学基金(20907047)；国家重点基础研究发展(973)计划(2012CB525005)

吴家兵(1989-)，男，硕士研究生，研究方向为职业环境毒理学，E-mail：wujiabing159@sina.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yyj580719@163.com

2015-09-23 录用日期：2015-10-28

1673-5897(2016)2-708-07

X171.5

A

简介：杨永坚(1958-)，男，学士，教授，主要从事环境与职业卫生研究，公开发表学术论文50余篇。

吴家兵, 杨永坚, 王先良, 等. 铅对人Bel-7402肝癌细胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影响[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 708-714

Wu J B, Yang Y J, Wang X L, et al. Lead toxicity to human liver cancer cells Bel-7402 and their effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 708-714 (in Chinese)

# 共同通讯作者(Co-corresponding author )， E-mail: xlwang@craes.org.cn